缺氧和福美雙對(duì)藏雞和肉雞脛骨血管化的作用機(jī)制及其對(duì)脛骨生長(zhǎng)的影響.pdf

1、脛骨軟骨發(fā)育不良(Tibial dyschondroplasia，TD)是一種家禽的營(yíng)養(yǎng)代謝性腿部疾病，主要在脛骨干骺端的肥大軟骨細(xì)胞區(qū)出現(xiàn)非血管化和非鈣化的不成熟的軟骨細(xì)胞堆積在生長(zhǎng)板，表現(xiàn)為軟骨內(nèi)骨化的異常。在1965年，該病最先在美國(guó)被Leach RM和MC Nesheim在青年肉雞上發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，隨后在火雞和鴨等家禽上也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，臨床主要表現(xiàn)為不愿站立，腿部骨骼變形，行動(dòng)緩慢并常常以雙翅來輔助行走，嚴(yán)重者喪失行走能力，影響采食。禽

2、類TD病在世界各國(guó)呈廣泛分布，沒有區(qū)域集中性或特意高發(fā)性，每年給全世界禽類行業(yè)造成不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。由于發(fā)病原因的復(fù)雜性，增加了研究其機(jī)理的難度性，肉雞發(fā)生TD的最根本的病因至今還不清楚。
　　藏雞(Tibetan chicken，TBC)主要生活在海拔2，200～4，100m的青藏高原農(nóng)牧地區(qū)，是世界上在高海拔低氧環(huán)境生活歷史最悠久的土著雞種，且至今未見有藏雞腿病的報(bào)道，這可能與其長(zhǎng)期生活在高海拔低氧環(huán)境有關(guān)。研究指出肉雞TD

3、的發(fā)生與脛骨生長(zhǎng)板血管生成的異常有關(guān)，而骨骼的形成過程都與血管生長(zhǎng)的過程是緊密相關(guān)的。鑒于此，我們對(duì)高海拔藏雞和低海拔肉雞進(jìn)行了對(duì)比研究，并驗(yàn)證高海拔低氧環(huán)境對(duì)低海拔肉雞的脛骨生長(zhǎng)發(fā)育的影響，也對(duì)肉雞TD的發(fā)生是否與脛骨生長(zhǎng)板血管生長(zhǎng)抑制有關(guān)作進(jìn)一步研究，同時(shí)更深入的研究肉雞發(fā)生TD時(shí)，脛骨生長(zhǎng)板血管生長(zhǎng)過程是如何調(diào)控的以及血管生成的減少如何影響脛骨的生長(zhǎng)和發(fā)育。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.藏雞與肉雞在生產(chǎn)性能和骨骼發(fā)育上的對(duì)比研

4、究
　　與生活在低海拔肉雞相比，藏雞在骨骼生長(zhǎng)方面是否存在什么特殊之處至今仍很大的未知。在同一月份內(nèi)，120只1日齡健康高海拔TBC和低海拔愛拔益加肉雞(Arbor Acres chicken，AAC)分別在兩地進(jìn)行飼養(yǎng)。結(jié)果顯示:TBC的采食量、日增重和體重，以及脛骨的重量、脛骨的長(zhǎng)度和脛骨生長(zhǎng)板的寬度均顯著低于低海拔AAC(p＜0.05)。然而，脛骨的組織病理觀察到藏雞脛骨生長(zhǎng)板區(qū)域血管的分布明顯增多。qRT-PCR結(jié)果顯示H

5、IF-1α、VEGFA以及其受體VEGFR1和VEGFR2在藏雞脛骨生長(zhǎng)板上的表達(dá)量均顯著高于低海拔AAC(p＜005)。ELISA結(jié)果也顯示類似的改變，整個(gè)試驗(yàn)期間藏雞血清VEGFA的蛋白含量均高于低海拔AAC。血清中VEGFR2和IL-8蛋白含量除了第7天低于AAC，在第3天、第10天和第14天均顯著高于AAC(p＞0.05)。這些結(jié)果表明，高海拔缺氧環(huán)境對(duì)TBC的身體和脛骨的生長(zhǎng)是抑制的。但藏雞脛骨生長(zhǎng)板區(qū)域分布豐富的血管，而且較

6、高血管生成調(diào)控基因HIF-1α、VEGFA以及其受體的表達(dá)，這可能就是TBC不發(fā)生TD的原因。
　　2.高海拔低氧環(huán)境對(duì)肉雞脛骨生長(zhǎng)板上HIF-1α/VEGF/VEGFR信號(hào)通路表達(dá)的影響
　　藏雞是青藏高原上一個(gè)土著的地方雞種，能夠?qū)Ξ?dāng)?shù)貒?yán)酷的高原低氧含量、低氣壓、高寒的環(huán)境有很好的適應(yīng)性。并且通過之前的研究發(fā)現(xiàn)藏雞脛骨生長(zhǎng)板區(qū)域擁有更豐富的血管分布，血管生長(zhǎng)相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)水平也較高。那么，高海拔低氧環(huán)境是否可以誘導(dǎo)脛骨

7、生長(zhǎng)板更多的血管分布還未深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選取120只健康低海拔AAC，運(yùn)輸?shù)礁吆０蔚貐^(qū)西藏進(jìn)行飼養(yǎng)，分為自然低氧組和正常氧氣組進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在高海拔低氧環(huán)境下AAC的生產(chǎn)性能和體重都受到抑制，死亡率增加;另外，脛骨的重量和長(zhǎng)度也不同程度受到抑制。然而，血液常規(guī)指標(biāo)顯示在低氧環(huán)境下AAC在第14天出現(xiàn)的紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白(Hb)和紅細(xì)胞壓積(Hct)增加。值得注意的是，脛骨的組織病理學(xué)分析顯示在自然低氧環(huán)境14天后AA

8、C脛骨生長(zhǎng)板區(qū)域血管密度顯著增加。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示肉雞在高海拔低氧的條件下，脛骨生長(zhǎng)板上缺氧應(yīng)激基因HIF-1α和血管生長(zhǎng)相關(guān)基因VEGFA和VEGFR1的表達(dá)水平都有顯著的過表達(dá)。ELISA檢測(cè)血清蛋白含量進(jìn)一步證實(shí)缺氧條件下可以增加血清中VEGFA、VEGFR2和IL-8的蛋白含量。這些結(jié)果說明，低海拔AAC生活在高海拔低氧環(huán)境下，可以通過調(diào)控機(jī)體缺氧應(yīng)激基因HIF-1α和血管生長(zhǎng)相關(guān)基因VEGFA和

9、它的受體的表達(dá)，促進(jìn)脛骨生長(zhǎng)板肥大軟骨細(xì)胞區(qū)血管分布的增加。
　　3.HIF-1α/VEGF/VEGFR信號(hào)通路在福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞上的作用機(jī)制
　　TD是一種比較棘手的家禽腿病問題，組織病理顯示在脛骨近端的生長(zhǎng)板上出現(xiàn)大面積的非血管化和非鈣化的“軟骨楔”為特征，導(dǎo)致骨骼鈣化不全，這可能與脛骨生長(zhǎng)板血管生成異常有關(guān)。然而，血管生成抑制在肉雞TD發(fā)生中所扮演的角色仍然還不清楚。通過福美雙誘導(dǎo)肉雞發(fā)生TD期間觀察到肉雞發(fā)生跛行

10、，脛骨生長(zhǎng)板增寬，呈白色的非血管區(qū)。對(duì)脛骨形態(tài)指標(biāo)測(cè)量顯示脛骨的重量和長(zhǎng)度減少，生長(zhǎng)板寬度及生長(zhǎng)板寬度系數(shù)增加。組織病理顯示AAC發(fā)生TD時(shí)，脛骨近端靜止區(qū)和增殖區(qū)血管的分布沒有顯著改變，而肥大軟骨細(xì)胞區(qū)血管的分布呈顯著的減少并且軟骨細(xì)胞大量死亡。另外，血常規(guī)指標(biāo)也顯示AAC發(fā)生TD時(shí)，RBC、Hb和Hct都顯著減少。接下來通過qRT-PCR、Western blot和ELISA的方法分別檢測(cè)脛骨生長(zhǎng)板上和肉雞血清中血管生成相關(guān)基因和蛋

11、白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:HIF-1α、VEGFA以及它的受體的基因表達(dá)和蛋白水平在第7天TD肉雞組都顯著的減少，并且這些基因的表達(dá)水平與脛骨生長(zhǎng)板血管的分布呈極強(qiáng)的正相關(guān)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)說明AAC發(fā)生TD時(shí)，機(jī)體可能是通過下調(diào)脛骨生長(zhǎng)板上血管生成相關(guān)基因和蛋白HIF-1α、VEGFA以及它的受體的表達(dá)，從而抑制脛骨肥大軟骨細(xì)胞區(qū)血管的分布，導(dǎo)致家禽脛骨生長(zhǎng)發(fā)育的抑制。
　　4.VEGF/FGF/Ang-1/PDGF-BB及其受體在

12、TD肉雞脛骨血管形成過程中的作用機(jī)制
　　先前的研究表明，骨骼是一種高度血管化的組織，并且依賴于血管生成與成骨形成之間的協(xié)調(diào)耦聯(lián)。既然血管生成的抑制和肉雞TD的發(fā)生具有極大的相關(guān)性，那么肉雞TD發(fā)生時(shí)，脛骨生長(zhǎng)板肥大區(qū)血管形成過程是如何被調(diào)控的仍不清楚。研究結(jié)果顯示:AAC發(fā)生TD時(shí)，中胚層分化的標(biāo)志性基因纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)和受體FGFR1表達(dá)水平下降;血管島形成標(biāo)志性基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和受體VEGFR

13、1\VEGR2的血清蛋白濃度被顯著降低;血管島成熟相關(guān)基因的調(diào)控包括血管生成素(Ang1，Ang2)以及它們的內(nèi)皮受體酪氨酸激酶Tie2等相關(guān)基因被抑制，這些或許將導(dǎo)致血管發(fā)生的推遲。另外，機(jī)體通過下調(diào)VEGFA和VEGFR1\VEGFR2受體基因和蛋白的表達(dá)，上調(diào)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB及受體PDGFR-β基因表達(dá)和血清蛋白水平的升高，導(dǎo)致脛骨生長(zhǎng)板血管的異常增殖和成熟，血管生成的減少?？傊?，肉雞發(fā)生TD時(shí)，血管生成的抑制

14、可能是通過抑制血管發(fā)生和血管生成過程的相關(guān)調(diào)控基因和蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致脛骨生長(zhǎng)板上血管分布的減少。
　　5.OPG/RANKL信號(hào)通路在TD肉雞脛骨生長(zhǎng)上的作用機(jī)制
　　TD肉雞血管形成的抑制勢(shì)必會(huì)影響骨的正常形成，那么骨生成過程發(fā)生怎樣的異常調(diào)控至今仍不清楚。研究結(jié)果顯示:與正常組AAC相比，肉雞發(fā)生TD時(shí)，肉雞的體重，脛骨的骨量、長(zhǎng)度和中央直徑都顯著減少，并且體重與脛骨的骨量呈正相關(guān)。組織病理和形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示TD肉雞脛

15、骨近端生長(zhǎng)板肥大區(qū)血管分布顯著減少，軟骨細(xì)胞呈核固縮和核溶解，生長(zhǎng)板寬度增加。血清生化結(jié)果顯示AAC發(fā)生TD時(shí)血清堿性磷酸酶(ALP)活性受到抑制，鈣磷平衡被破壞。另外，通過qRT-PCR和ELISA檢測(cè)脛骨生長(zhǎng)板和血清中調(diào)控骨骼生成相關(guān)基因和蛋白發(fā)現(xiàn)TD肉雞脛骨生長(zhǎng)板和血清中骨保護(hù)素(OPG)基因和蛋白的表達(dá)都顯著受到抑制，核因子κB受體活化因子配體(RANKL)表達(dá)水平上調(diào)，這將促進(jìn)其受體核因子-κB受體活化因子(RNAK)信號(hào)的激

16、活。并且OPG的水平與脛骨生長(zhǎng)板上血管的分布以及脛骨的生長(zhǎng)呈正相關(guān)，RANKL呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果說明肉雞TD發(fā)生時(shí)，脛骨近端血管浸入的減少導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的死亡影響骨架的延伸，同時(shí)死亡軟骨細(xì)胞在生長(zhǎng)板肥大軟骨細(xì)胞的堆積，在生長(zhǎng)板處形成嚴(yán)重的損傷區(qū)域。另外，肥大軟骨細(xì)胞區(qū)血管侵入的減少，血清鈣磷水平的失調(diào)影響肥大區(qū)軟骨基質(zhì)的鈣化。基因水平進(jìn)一步說明，促進(jìn)骨形成的OPG基因被抑制，而RNAKL基因的上調(diào)，促進(jìn)RNAK信號(hào)激活破骨細(xì)胞的骨吸收功能

17、，從而影響骨的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致骨量的減少。
　　總之，試驗(yàn)通過對(duì)藏雞的研究首次揭示藏雞不發(fā)生脛骨軟骨發(fā)育不良的生理機(jī)制可能是通過長(zhǎng)期的高海拔低氧環(huán)境適應(yīng)，上調(diào)HIF-1α，VEGF以及其受體基因的表達(dá)，提高脛骨生長(zhǎng)板上血管的侵入有關(guān);而且，高海拔缺氧環(huán)境對(duì)肉雞的影響進(jìn)一步證實(shí)這一作用機(jī)制。另外，福美雙誘導(dǎo)的肉雞TD模型顯示脛骨生長(zhǎng)板上VEGF以及其受體VEGFR1和VEGFR2基因的異常表達(dá)，抑制脛骨生長(zhǎng)板血管化與肉雞TD發(fā)生存在極強(qiáng)的