Cathepsin L在冠心病側(cè)枝循環(huán)建立中作用的機(jī)制探討.pdf

1、第一部分CathepsinL與冠心病側(cè)枝循環(huán)的臨床研究
　　目的：觀察冠心病病人中，側(cè)枝循環(huán)的建立與CathepsinL及其相關(guān)蛋白的關(guān)聯(lián)性。
　　方法：臨床診斷冠心病的病人，在行冠脈造影時(shí)留取動(dòng)脈血，用ELISA檢測(cè)血清中CathepsinL，CystatinC，endostatin，PLGF等的水平，同時(shí)分析冠脈造影圖像，按照Rentrop評(píng)分將不同側(cè)枝循環(huán)患者進(jìn)行分組，分析CathepsinL相關(guān)因子與側(cè)枝循環(huán)的相關(guān)性

2、，采用spss統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果。
　　結(jié)果：1.側(cè)枝循環(huán)豐富的冠心病患者其血漿中的CathepsinL，PLGF水平均較高，這兩個(gè)因子與側(cè)枝循環(huán)獨(dú)立相關(guān)。2.糖尿病組中，側(cè)枝豐富組含有較高濃度的CathepsinL，而非糖尿病組，側(cè)枝豐富組含有較高PLGF，這也許是因?yàn)樘悄虿〔∪藘?nèi)環(huán)境中炎癥反應(yīng)的增加，從而導(dǎo)致CathepsinL表達(dá)量的增加。3.無論起病方式如何，側(cè)枝豐富組比側(cè)枝不良組均含有較高濃度的CathepsinL和PLG

3、F。提示，CathepsinL/PLGF與側(cè)枝循環(huán)的關(guān)系可能不受局部動(dòng)脈病變影響。4.ROC曲線分析，CathepsinL水平>22.43nM的“截值”能發(fā)現(xiàn)更多的豐富側(cè)枝(敏感性，42.6％：特異性，79.3％)。
　　結(jié)論：CathepsinL與側(cè)枝循環(huán)的聯(lián)系揭示了CathepsinL的促血管新生作用。
　　第二部分CathepsinL對(duì)HUVEC生物學(xué)特性的影響
　　目的：觀察Cathepsin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特

4、性的影響。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)液中加入小劑量的天然CathepsinL蛋白(10nM)，大劑量的天然CathepsinL蛋白(30nM)以及CathepsinL特異性抑制劑Z-FF-FMK(10uM)，培養(yǎng)HUVEC24h后，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，涂有膠原的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移/侵潤(rùn)能力。
　　結(jié)果：1.小劑量外源性CathepsinL具有抑制細(xì)胞增殖的作用，而大劑量外源

5、性CathepsinL蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。抑制細(xì)胞內(nèi)源性CathepsinL后，細(xì)胞增殖率有所增加。而無論是細(xì)胞增殖增加還是受抑制，統(tǒng)計(jì)結(jié)果都沒有達(dá)到顯著性意義。這就提示，CathepsinL對(duì)細(xì)胞增殖的作用不明顯。2.外源性CathepsinL蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且隨著CathepsinL蛋白濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡率成劑量依賴性增加，而抑制細(xì)胞內(nèi)源性CathepsinL蛋白的表達(dá)，則使細(xì)胞早期凋亡水平明顯降低了近一半(早期

6、凋亡率：3.37％，vs對(duì)照組早期凋亡率6.078％，P<0.05)，這就進(jìn)一步提示了CathepsinL對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。3.外源性CathepsinL蛋白具有明顯的促細(xì)胞遷移/侵潤(rùn)的作用，而特異性的抑制了細(xì)胞內(nèi)CathepsinL蛋白的表達(dá)后，則抑制了細(xì)胞的遷移/侵潤(rùn)。
　　結(jié)論：CathepsinL可能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移/侵潤(rùn)來促血管新生，同時(shí)，CathepsinL還具有明顯的促細(xì)胞凋亡的作用。
　　第三部分Ca

7、thepsinL在高糖/高軟脂酸刺激下對(duì)HUVEC血管新生功能的調(diào)控
　　目的：觀察高糖/高軟脂酸刺激下CathepsinL對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖，凋亡及遷移的影響，同時(shí)觀察高糖/高軟脂酸對(duì)HUVEC的CathepsinL蛋白表達(dá)和活性的影響。
　　方法：分別用不同濃度的葡萄糖/軟脂酸培養(yǎng)HUVEC，培養(yǎng)液中加入小劑量的天然CathepsinL蛋白(10nM)，大劑量的天然CathepsinL蛋白(30HM)以及Catheps

8、inL特異性抑制劑Z-FF-FMK(10uM)。培養(yǎng)HUVEC24h后，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，涂有膠原的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移。同時(shí)，采用Realtime-PCR檢測(cè)細(xì)胞CathepsinL的mRNA表達(dá)，采用Western-blot檢測(cè)CathepsinL的蛋白表達(dá)，采用熒光酶底物法檢測(cè)細(xì)胞CathepsinL的活性。
　　結(jié)果：1.高糖/高軟脂酸高能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡

9、，抑制細(xì)胞遷移/侵潤(rùn)。2.大劑量的外源性CathepsinL蛋白能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移/侵潤(rùn)，而特異性的抑制細(xì)胞內(nèi)CathepsinL后，細(xì)胞遷移/侵潤(rùn)明顯減少。3.大劑量的Cathepsin對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，而特異性的抑制細(xì)胞內(nèi)CathepsinL后細(xì)胞凋亡減少。4.高糖/高軟脂酸能夠降低CathepsinL的活性，而不改變CathepsinL的基因和蛋白表達(dá)，提示高糖/高軟脂酸可能通過翻譯后修飾環(huán)節(jié)來影響CathepsinL的。