腎陰虛型老年癡呆病證結(jié)合樹鼩動物模型的構(gòu)建和六味地黃丸的藥效評價.pdf

1、目的:腎虛證是老年癡呆較常見的證型，研究腎虛型老年癡呆病及抗癡呆的中藥治療，意義重大。并且樹鼩是研究腦疾病方面較理想的實驗動物。本研究旨在以樹鼩為對象，構(gòu)建腎陰虛型老年癡呆病模型，為防治老年性癡呆及相關(guān)藥物的研發(fā)提供病證結(jié)合的動物模型。
　　方法:
　　(1)腎陰虛型樹鼩動物模型的建立。摸索出氫化可的松造腎陰虛證的給藥途徑、最佳劑量、給藥時間。方法一:分別腹腔注射生理鹽水、低劑量（1mg/100g體重）氫化可的松、中劑量（1

2、.5mg/100g體重）氫化可的松、高劑量（2mg/100g體重）氫化可的松，連續(xù)5天。方法二:分別腹腔注射生理鹽水、低劑量（1mg/100g體重）氫化可的松、高劑量（1.5mg/100g體重）氫化可的松，連續(xù)7天。在造模期間每天測量樹鼩體重并觀察毛發(fā)、糞便等一般狀態(tài)。在給藥結(jié)束后，測量每組動物血清中游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、雌二醇(E2)、睪酮、皮質(zhì)醇(CORT)的含量，臟器指數(shù)。
　　(2)老年癡

3、呆樹鼩動物模型的建立。方法一:分別腹腔注射生理鹽水、低劑量（0.5ml/100g體重）0.96％D-半乳糖、高劑量（0.5ml/100g體重）1.92％D-半乳糖，連續(xù)6周。6周后造模組進(jìn)行雙側(cè)腦室注射鵝膏蕈氨酸(IBO)5μg，空白組在相應(yīng)位置注射生理鹽水。方法二:分別雙側(cè)腦室注射生理鹽水、低劑量(Aβ25-355μg+IBO5μg)、高劑量（Aβ25-3510μg+IBO5μg）。在造模期間每天測量樹鼩體重并觀察毛發(fā)、糞便等一般狀態(tài)

4、。在給藥結(jié)束后測量臟器指數(shù)，觀察腦組織病理形態(tài)變化，比較腦組織中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(CHAT)、突觸素(SYP)、APP、Aβ1-42、磷酸化tau(P-tau)、去甲腎上腺素(NE)的含量。
　　(3)腎陰虛型老年癡呆模型的建立和六味地黃丸的干預(yù)作用。將動物隨機(jī)分成四組?？瞻捉M:第一天雙側(cè)腦室注射生理鹽水，之后腹腔注射生理鹽水連續(xù)3天，灌胃蒸餾水連續(xù)10天;AD組:第一天雙側(cè)腦室同時注射Aβ25.3510μg和IBO5μg，之后腹腔

5、注射生理鹽水連續(xù)3天，灌胃蒸餾水連續(xù)10天;腎陰虛型AD組:第一天雙側(cè)腦室同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg，之后腹腔注射氫化可的松（1mg/100g體重）連續(xù)3天，灌胃蒸餾水連續(xù)10天;六味地黃丸治療組:第一天雙側(cè)腦室同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg，之后腹腔注射氫化可的松（1mg/100g體重）連續(xù)3天，灌胃六味地黃丸（1mg/100g體重，2mg/ml）連續(xù)10天。在給藥造模期間每天測量樹鼩體重記錄一般狀態(tài)。

6、在給藥結(jié)束后，測量相應(yīng)的生化指標(biāo)、臟器指數(shù)、觀察腦組織的病理形態(tài)變化、比較腦組織中CHAT、SYP、APP、Aβ1-42、P-tau、NE的含量。
　　結(jié)果:
　　(1)在腎陰虛模型部分，方法一:與空白組比較，高劑量組出現(xiàn)肌肉萎縮，四肢瘦癟少光澤，皮膚疏松，但活動力差，狀態(tài)不好;中劑量組出現(xiàn)大便干結(jié)，肌肉萎縮，四肢瘦癟少光澤，皮毛無光澤，活力較強(qiáng);低劑量組皮毛無光澤，生命指征良好，皮質(zhì)醇水平顯著下降(p＜0.05)。方法二:

7、高劑量組出現(xiàn)大便干結(jié)、肌肉萎縮、四肢瘦癟少光澤、皮毛無光澤且生命體征較弱，F(xiàn)T3和睪酮水平均顯著下降(p＜0.05），甲狀腺指數(shù)顯著降低(p＜0.05）;低劑量組出現(xiàn)易驚躁動、大便干結(jié)、肌肉萎縮、皮毛無光澤，F(xiàn)T3和CORT水平顯著降低(p＜0.05)，E2水平顯著升高(p＜0.05)。結(jié)果表明，方法二中的低劑量(1mg/100g)，腹腔注射連續(xù)7天后，樹鼩的狀態(tài)及各項指標(biāo)較符合腎陰虛證的表現(xiàn)。
　　(2)在老年癡呆模型部分，方法

8、一:與空白組比較，高劑量組一般狀態(tài)變化為毛發(fā)少光澤且掉毛嚴(yán)重，食盒中有糞便;腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，胞漿、胞核界限不明顯，細(xì)胞周圍間隙大，排列紊亂，神經(jīng)纖維排列雜亂，錐體細(xì)胞大量缺失;CHAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目和SYP反應(yīng)產(chǎn)物的量大量減少，平均截面積非常顯著下降(p＜0.01);APP、Aβ1-42、 P-tau蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01），腦組織的NE含量顯著減少(p＜0.05）。低劑量組一般狀態(tài)變化為躁

9、動易驚，上下逃竄，毛發(fā)少光澤，掉毛，食盒中有糞便;腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，細(xì)胞稀疏，錐體細(xì)胞變小;CHAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量和SYP反應(yīng)產(chǎn)物的量減少，平均截面積非常顯著降低(p＜0.01); APP、Aβ1-42、P-tau蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01）。方法二:高劑量組一般狀態(tài)變化為毛發(fā)少光澤且掉毛嚴(yán)重，將糞便拉在食盒當(dāng)中，體重顯著性降低(p＜0.05）;腦組織中神經(jīng)元發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，胞漿、胞核界限不

10、明顯，細(xì)胞周圍間隙大，排列紊亂，神經(jīng)纖維排列雜亂，錐體細(xì)胞大量缺失;CHAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量和SYP反應(yīng)產(chǎn)物的量大量減少，平均截面積非常顯著降低(p＜0.01)，CHAT的平均光密度非常顯著性降低(p＜0.01);APP、Aβ1-42、 P-tau蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01);腦組織的NE含量顯著減少(p＜0.05）。低劑量組一般狀態(tài)改變不大，有輕微掉毛，體重顯著性降低(p＜0.05）;腦組織神經(jīng)元發(fā)生核固縮成不規(guī)則形，

11、胞漿、胞核界限不明顯，細(xì)胞稀疏，錐體細(xì)胞變小;CHAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量后和SYP反應(yīng)產(chǎn)物的量減少，平均截面積非常顯著降低(p＜0.01)，CHAT平均光密度非常顯著降低(p＜0.01);APP、Aβ1-42、P-tau化蛋白的灰度值非常顯著性增多(p＜0.01）。結(jié)果表明，1.92％D-半乳糖(0.5ml/100g體重)復(fù)合雙側(cè)腦室注射IBO5μg，雙側(cè)腦室同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg均能夠較好的造成老年癡呆病樹鼩模型

12、，并且雙側(cè)腦室同時注射Aβ25-35和IBO造模周期短，樹鼢死亡率低，更符合實驗要求。
　　(3)在腎陰虛老年癡呆病樹鼩動物模型的建立和六味地黃丸的干預(yù)作用部分。與空白組比較，AD組出現(xiàn)活動度較差，毛發(fā)少光澤，掉毛，食盒中有糞便;肝指數(shù)，脾指數(shù)，腎指數(shù)，腎上腺指數(shù)，睪丸指數(shù)均顯著性下降(p＜0.05);尿素非常顯著性升高(p＜0.01); HE染色結(jié)果，神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，核固縮成不規(guī)則形、三角形，胞漿、胞核界限不明顯，細(xì)胞變得稀

13、疏，錐體細(xì)胞缺失、變小;CHAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體變形，排列較松散，CHAT的平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01)，平均光密度有顯著性降低(p＜0.05); SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的細(xì)胞排列間隙過大，數(shù)量少，平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01)，平均光密度有顯著性下降(p＜0.05);在APP、 Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性上升(p＜0.01); NE含量顯著性降低(p＜0.05)。腎虛AD組活動度很

14、差，肌肉萎縮嚴(yán)重，毛發(fā)少光澤，掉毛嚴(yán)重;肝指數(shù)顯著性下降(p＜0.05)，腎上腺指數(shù)非常顯著性下降(p＜0.01); FT3顯著性下降(p＜0.05);尿素和肌酐非常顯著性升高(p＜0.01);神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變，核固縮成不規(guī)則形、三角形，胞漿、胞核界限不明顯，細(xì)胞周圍間隙過大，排列紊亂，神經(jīng)纖維排列雜亂，錐體細(xì)胞變小、大量缺失;CHAT免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體變形，排列較松散，平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01)，平均光

15、密度有顯著性降低(p＜0.05);突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物的細(xì)胞排列間隙過大，數(shù)量較少，平均截面積有非常顯著性降低(p＜0.01);在APP、Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性上升(p＜0.01); NE含量非常顯著性降低(p＜0.01)。與AD組比較，六味地黃丸組，F(xiàn)T4和CORT顯著性增多(p＜0.05)，E2顯著性下降(p＜0.05);尿素非常顯著性下降(p＜0.01); CHAT免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞平均截面積和突觸素反應(yīng)產(chǎn)物的平

16、均截面積有非常顯著性升高(p＜0.01);在APP、Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性下降(p＜0.01)。與腎虛AD組比較，六味地黃丸組狀態(tài)體征良好，灌胃治療后毛發(fā)長出，活動度較好，食盒中無糞便;FT4顯著性增加(p＜0.05)，E2非常顯著性下降(p＜0.01);尿素和肌酐均非常顯著性下降(p＜0.01); CHAT免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞平均截面積非常顯著性升高(p＜0.01);突觸素反應(yīng)產(chǎn)物的平均截面積有非常顯著性升高(p＜0

17、.01);在APP、 Aβ1-42、P-tau水平上均非常顯著性下降(p＜0.01);NE含量非常顯著性升高(p＜0.01)。以上結(jié)果可認(rèn)為腎陰虛型老年癡呆病的造模成功以及六味地黃丸對腎陰虛型老年癡呆病的樹鼩動物有較好的治療作用。
　　結(jié)論:腹腔注射氫化可的松，按1mg/100g體重劑量，連續(xù)給藥7天是造成腎虛證樹鼩模型的較好方法;雙側(cè)腦室基底核同時注射Aβ25-3510μg和IBO5μg，是造成老年癡呆樹鼩模型的較佳方法。雙側(cè)腦