血管抑素與絲裂霉素C對原發(fā)性翼狀胬肉作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　 翼狀胬肉是眼科的常見病、多發(fā)病，為結(jié)膜組織的增生變性疾病。當翼狀胬肉不斷進展，會牽拉角膜形成散光，影響視力及患者的美觀，其次，因為肥厚的體部造成眼部異物感、流淚等不適癥狀都促使患者就醫(yī)。
　　 翼狀胬肉的具體發(fā)病機制還不是十分明確，但是隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對翼狀胬肉的發(fā)病機制的研究越來越深入，越來越多的研究顯示:翼狀胬肉是一種增生性疾病。從近幾年的病理學(xué)和病理生理學(xué)研究可發(fā)現(xiàn):新生血管和纖維結(jié)締組織

2、是翼狀胬肉上皮下的主要結(jié)構(gòu)。特別是最近國外一些關(guān)于翼狀胬肉細胞因子的基礎(chǔ)學(xué)研究結(jié)果顯示:血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)標記陽性的細胞數(shù)量和密度在翼狀胬肉組織中含量明顯比正常結(jié)膜組織中的增多及堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有促進微血管內(nèi)皮細胞VEGF合成和分泌作用，而它存在于成纖維細胞培養(yǎng)上清液中。從這

3、些基礎(chǔ)研究我們可以看出新生血管的形成在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的作用，以及新生血管或血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞之間存在的密切關(guān)系，以上這些因素共同參與并促進了翼狀胬肉的形成和發(fā)展。
　　 由以上研究及發(fā)現(xiàn)可知，新生血管形成對于翼狀胬肉發(fā)生、發(fā)展具有重要的促進作用。在新生血管的形成過程中，血管新生刺激因素和抑制因素缺一不可。目前發(fā)現(xiàn)較多的血管新生刺激因素包括多種生長因子和細胞因子，如VEGF、成纖維生長因子(FGF)等。血管

4、新生抑制因素主要由血管抑素，內(nèi)皮抑素等組成。血管抑素(Angiostation AS)是被國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)的目前最強有力的最重要的新生血管生成抑制劑之一，可以抑制基質(zhì)增強的纖溶酶原的活性導(dǎo)致細胞侵犯。多項實驗研究均顯示血管抑素作用的直接靶點為新生血管的內(nèi)皮細胞，而對其他細胞及正常靜止狀態(tài)的內(nèi)皮細胞無抑制作用。從理論上可以認為血管抑素通過抑制新生血管形成達到輔助治療抑制復(fù)發(fā)的目的。
　　 雖然對于翼狀胬肉的主要治療方案仍是手術(shù)治療，但

5、是近年來根據(jù)對翼狀胬肉的發(fā)病機制研究、動物實驗、細胞培養(yǎng)和臨床實驗研究，并針對發(fā)病機制和原理，出現(xiàn)多種治療方法及治療藥物，以期望盡量降低術(shù)后復(fù)發(fā)率以致避免復(fù)發(fā)的可能性，主要包括:絲裂霉素C(MMC)應(yīng)用、激素治療、冷凍治療、激光治療。雖然目前對于翼狀胬肉的治療方法多樣，也有一定降低復(fù)發(fā)率的效果，但仍然未有一種療效較為確切、實用，復(fù)發(fā)率低的治療方法。
　　 本課題主要目的是通過配制血管抑素眼用制劑聯(lián)合應(yīng)用MMC，以研究血管抑素眼用

6、制劑聯(lián)合應(yīng)用MMC對翼狀胬肉的術(shù)后復(fù)發(fā)的抑制作用及可能機制。主要研究內(nèi)容:
　　 一、血管抑素與絲裂霉素對離體翼狀胬肉的作用研究
　　 （一）目的:
　　 血管抑素(AS)聯(lián)合絲裂霉素C(MMC)對離體培養(yǎng)的翼狀胬肉組織的作用研究。
　　 （二）方法:
　　 將20例臨床手術(shù)切除的原發(fā)性翼狀胬肉標本浸潤于DHanks液中，然后利用組織塊培養(yǎng)法采用含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細胞常規(guī)培養(yǎng)于溫箱

7、中。待原代細胞貼壁培養(yǎng)生長至基本鋪滿培養(yǎng)瓶底時用0.25％胰酶消化，按比例1∶2繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取第3代或第4代細胞用SABC法進行抗波形蛋白免疫細胞化學(xué)染色進行細胞鑒定，鑒定后用于實驗。用MTT法測定血管抑素、絲裂霉素C對人翼狀胬肉細胞增殖的影響:實驗分為四組:分別為A組（空白對照培養(yǎng)組）、B組(50ml/L血管抑素培養(yǎng)組)、C組（0.2mg/mL絲裂霉素培養(yǎng)組）、D組（50ml/L血管抑素與0.2mg/mL絲裂霉素聯(lián)合培養(yǎng)組），主要觀

8、察翼狀胬肉細胞在各培養(yǎng)組的生長情（包括數(shù)量和形態(tài)等情況）及吸光度值情況，計算不同時間、不同質(zhì)量濃度的血管抑素對人翼狀胬肉細胞的抑制率，記錄實驗結(jié)果;以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線;通過觀察用藥后24h、48h、72h三組翼狀胬肉細胞中VEGF蛋白及bFGF蛋白的表達含量比較抑制率;通過RT-PCR分析總的mRNA的表達情況，以Folds=2-△△Ct表示VEGF與bFGF mRNA在實驗組與對照組中表達的倍比關(guān)系;通過We

9、stern blot探討VEGF與bFGF總蛋白的表達情況，根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析，所得數(shù)據(jù)以(x)±s表示，MTT實驗數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計資料方差分析，PCR數(shù)據(jù)采用兩兩配對檢驗;以P＜0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。
　　 （三）結(jié)果:
　　 1、MTT法測定血管抑素絲裂霉素對人翼狀胬肉細胞增殖的影響
　　 不同藥物作用于人翼狀胬肉細胞24 h后，可見A組細胞排列緊密，

10、增生明顯，有連成片的趨勢;B組與C組細胞呈點片狀增生，排列疏密有致;D組細胞呈稀疏狀排列。A490吸光度值均低于對照組，對人翼狀胬肉增殖的抑制作用隨著各實驗藥物的改變而不同。D組的人翼狀胬肉細胞于24，48，72h后較A、B、C三組明顯受抑制，實驗組吸光度值均低于對照組，各組之間經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗具有統(tǒng)計學(xué)差異(F=433.4 P＜0.01);各實驗組的抑制作用較對照組明顯增強，B、C組抑制作用相當，D組的抑制作用最強，且各實驗組的抑制作用隨

11、時間的延長逐漸增強;72h時最大抑制率達到80.00％，且與對照組相比差異均有顯著性意義(P＜0.01)。說明血管抑素聯(lián)合絲裂霉素對離體培養(yǎng)的翼狀胬肉細胞的抑制作用高于前三組。
　　 2、實時熒光定量PCR結(jié)果
　　 以2-△△Ct作為統(tǒng)計量，實驗組中的VEGF mRNA與bFGF mRNA總和與對照組的表達比較有顯著差異(P=0.000);B組與C組中的VEGF mRNA與bFGFmRNA總和的表達無顯著差異(P=0.

12、931);A與D組比較存在顯著差異(P=0.000);B組、C組與D組比較存在顯著差異(t=-6.904，P=0.002)。與A組比較B、C、D組VEGF與bFGF mRNA的表達分別下降了約40％、40％、73％。D組總mRNA明顯高于A、B、C三組。
　　 3.各組VEGF與bFGF總蛋白表達的影響
　　 Western blot結(jié)果顯示各實驗組作用人翼狀胬肉細胞后，三組中VEGF蛋白表達含量不同，且隨著實驗組添加藥

13、物不同而蛋白表達不同，D組的蛋白表達量明顯低于A、B、C三組。
　　 （四）結(jié)論
　　 血管抑素與絲裂霉素對翼狀胬肉組織均有抑制作用，當兩種藥物同時使用時，抑制作用明顯增強;為在人體翼狀胬肉患者中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但是對于該兩種藥物不同濃度梯度的抑制作用及正常結(jié)膜組織的損傷等作用未能通過實驗中進一步分析。
　　 二、血管抑素聯(lián)合絲裂霉素C防止原發(fā)性翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床療效觀察
　　 （一）目的:
　

14、　 觀察血管抑素(Angiostatin AS)聯(lián)合絲裂霉素C(Mitomycin MMC)防止原發(fā)性翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)的臨床療效。
　　 （二）方法:
　　 根據(jù)擬定的納入標準，選自2008年2月至2011年8月在我院就診的原發(fā)性翼狀胬肉患者365例（369眼），其中男性187例（189眼），女性178例(180眼)，年齡35-75歲。隨機分成3組，分別采用A組行逆行性翼狀胬肉切除術(shù)聯(lián)合絲裂霉素（121眼），B組行逆行

15、性翼狀胬肉切除術(shù)聯(lián)合血管抑素（122眼），C組行逆行性翼狀胬肉切除術(shù)聯(lián)合絲裂霉素及血管抑素（126眼）等方法治療，按Prabhasawat等標準進行裂隙燈下療效評定。365例患者均為初次手術(shù)，手術(shù)均在顯微鏡下由同一醫(yī)師完成:常規(guī)消毒、鋪巾、麻醉后，利用彎剪充分游離翼狀胬肉與鞏膜面后，用有齒鑷夾住翼狀胬肉的頸部，將胬肉頭部從角膜面旋撕分離。殘余組織用顯微無齒鑷夾起撕掉，分離并剪除胬肉體部結(jié)膜下的纖維組織，燒灼止血暴露術(shù)區(qū)鞏膜3mm×4mm

16、。其中A組MMC的應(yīng)用:將浸有新配制的0.2mg/mL MMC的棉片放于胬肉體、根部球結(jié)膜下鞏膜暴露區(qū)范圍，5min后去除棉片，用100ml生理鹽水徹底沖洗術(shù)區(qū)，將其游離緣間斷縫合兩針固定于淺層鞏膜上;B組:結(jié)膜縫合方法同A組，術(shù)后第1d開放點眼，30μg/mL濃度的血管抑素溶液，用藥1周;C組:MMC應(yīng)用同A組，血管抑素應(yīng)用同B組。術(shù)后給予常規(guī)抗感染、營養(yǎng)促修復(fù)等治療，隨訪12～18個月，比較其復(fù)發(fā)率。藥品:日本株式會社生產(chǎn)絲裂霉素C

17、2mg/瓶，制備0.2mg/mL MMC溶液。血管抑素原液由中山大學(xué)生命科學(xué)院提供，制備成30μg/mL濃度的溶液。所制備的藥品置于4℃冰箱保存（最長時間不超過1wk）備用。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 （三）、結(jié)果
　　 觀察12-18月，A組治愈121眼，復(fù)發(fā)9眼，復(fù)發(fā)率為7.4％，其中2眼復(fù)發(fā)于術(shù)后前3個月，其余7眼復(fù)發(fā)于第9-12個月，術(shù)后輕度不適12只眼

18、;B組治愈122眼，復(fù)發(fā)7眼，復(fù)發(fā)率為5.7％，其中2眼復(fù)發(fā)于術(shù)后前3個月，其余5眼復(fù)發(fā)于第9-12個月，術(shù)后輕度不適10只眼;C組治愈126眼，復(fù)發(fā)1眼，復(fù)發(fā)率為:0.8％，術(shù)后12個月復(fù)發(fā)，術(shù)后輕度不適11只眼;三組均未見嚴重術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果示:經(jīng)多個獨立樣本率x2檢驗得出x2=6.731P=0.035(P＜0.05)，3組間差異具有顯著性意義，可認為不同的治療方法的復(fù)發(fā)率有顯著差異，根據(jù)平均秩次進一步得出:逆行性切除法聯(lián)