內(nèi)含不同類型RNA的重組MS2噬菌體病毒樣顆粒的表達及其應用研究.pdf

1、H7N9禽流感病毒是一種新亞型流感病毒，于2013年3月在我國上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)。H7N9禽流感病毒感染后的死亡率較高，因此對該病毒早期準確的診斷成為挽救患者生命的關鍵。
　　作為一種RNA病毒，H7N9禽流感病毒的實驗室檢測包括病毒核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴增等多個步驟，每一步操作不當均會導致檢測出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，誤導臨床診斷，延誤患者的治療。為了提高全國醫(yī)院實驗室和流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室H7N9禽流感病毒的檢測能力，2013年

2、7月衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織了一次室間質(zhì)量評價。我們制備了基于MS2噬菌體病毒樣顆粒(Bacteriophage MS2 virus-likeparticles，MS2 VLPs)的內(nèi)含H7N9禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein，MP)和核蛋白(Nucleoprotein，NP)四種蛋白全長RNA序列的質(zhì)控品，向全國參與H7N9病毒檢

3、測的醫(yī)院實驗室和流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室發(fā)放，以評價參評實驗室H7N9禽流感病毒的檢測能力，指導實驗室提高檢測水平。所發(fā)放的樣本盤含有10個樣本，其中包括6個含不同濃度H7N9禽流感病毒基因的陽性樣本和4個H7N9陰性樣本（包括1個MP基因陽性的樣本）。樣本盤發(fā)放到全國79家進行H7N9禽流感病毒分子檢測的實驗室，并根據(jù)實驗室H7和N9兩個基因的檢測情況對結(jié)果進行了分析。我們共收到80份回報結(jié)果（其中一家實驗室回報了2份結(jié)果），其中77份結(jié)果

4、采用real-time RT-PCR方法進行檢測:60份采用商品化試劑盒檢測，17份采用實驗室自配試劑檢測;還有3份結(jié)果采用等溫擴增法檢測。統(tǒng)計結(jié)果顯示82.5％的實驗室能夠正確檢測不同濃度的H7N9禽流感病毒樣本及陰性樣本。但是仍有17.5％的實驗室需要改進檢測能力，有待改進的實驗室中大部分漏檢了相對較低濃度的N9基因?？傮w檢測的假陰性率為5.6％，假陽性率為0.6％，選用不同的檢測試劑盒和檢測方法得山的結(jié)果不盡相同。本次室間質(zhì)量評價

5、的結(jié)果表明我國大多數(shù)核酸檢測實驗室具備了H7N9禽流感病毒核酸檢測的能力。
　　MS2 VLPs不僅能夠包裝外源mRNA，還可以用于miRNAs前體的包裝，用來作為miRNAs的遞送載體。在第二部分中，我們通過對MS2 VLPs表達質(zhì)粒進行改造，制備了表面展示細胞穿透肽HIV-1 TAT且內(nèi)含miR-122前體的重組MS2VLPs—TAT-MS2-miR122 VLPs，進一步實驗結(jié)果顯示TAT-MS2-miR122 VLPs能夠

6、攜帶miR-122前體進入Hep3B肝癌細胞系，在細胞內(nèi)加工成成熟的miR-122，使Hep3B細胞內(nèi)miR-122表達水平升高，高表達的miR-122通過對腫瘤相關靶蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的作用。這一部分中我們將兩條重復的MS2噬菌體衣殼蛋白編碼序列串聯(lián)組成單鏈二聚體，并在單鏈二聚體序列的N端插入帶有連接臂的穿透肽HIV-1 TAT的cDNA序列，隨后把這一嵌合序列構建到真核表達質(zhì)粒pESC-URA的Gal10啟動子下游;將與

7、包裝位點序列串聯(lián)的pre-miR-122序列構建到Gal1啟動子的下游，構建完成的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母細胞中，搖菌表達得到TAT-MS2-miR122 VLPs。結(jié)果顯示采用不同劑量的TAT-MS2-miR122 VLPs處理三種不同類型的細胞，均檢測到miR-122表達水平不同程度的升高，可持續(xù)穩(wěn)定約120小時。TAT-MS2-miR122 VLPs處理Hep3B細胞后，伴隨著miR-122水平的升高，Western Blot檢測到

8、miR-122的兩個靶蛋白胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor1 receptor, IGF1R)和去整合素樣金屬蛋白酶10(Adisintegrin and metalloproteinase10，ADAM10)表達水平下降。IGF1R和ADAM10均在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，兩種蛋白表達下降將影響Hep3B細胞的生長。細胞增殖和凋亡實驗的檢測結(jié)果證實了TAT-MS2-miR122