二氯異氰尿酸鈉滅活MS2噬菌體效果及機(jī)理的初步研究.pdf

1、目的：為MS2噬菌體替代脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型(PV-Ⅰ)疫苗株作為指示病毒用于消毒劑效果評(píng)價(jià)提供進(jìn)一步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，試驗(yàn)觀察MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性以及對(duì)二氯異氰尿酸鈉消毒劑(NaDDC)的抵抗力，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究二氯異氰尿酸鈉作用MS2噬菌體的滅活機(jī)理。 方法： 1．MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性研究 1．1 MS2噬菌體增殖特性的研究：方法參照文獻(xiàn)作適當(dāng)改動(dòng)進(jìn)行研究。按照感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為0.

2、0001、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌，37℃160r/min培養(yǎng)4h后，測(cè)定噬菌體滴度；加入噬菌體及宿主菌，使MOI=10，37℃溫育15 min后，進(jìn)行一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，于各時(shí)間取樣300μl測(cè)定上清中噬菌體滴度； 1．2 MS2噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的研究：參照Lu等的方法，略有改動(dòng)。 1．3 MS2噬菌體的宿主菌范圍研究：主要采用雙層瓊脂法測(cè)定MS2噬菌體對(duì)各試驗(yàn)菌株的感染裂解情況，觀

3、察MS2噬菌體的噬菌斑生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)，并初步比較MS2噬菌體在相關(guān)宿主菌內(nèi)的易感性。 1．4 MS2噬菌體對(duì)消毒劑抵抗力的研究：采用懸液定量滅活試驗(yàn)、中和劑鑒定試驗(yàn)、噬菌體的檢測(cè)采用雙層瓊脂法，實(shí)驗(yàn)參照消毒技術(shù)規(guī)范(2002版)規(guī)定，并作適當(dāng)修改；選擇二氯異氰尿酸鈉消毒劑，觀察其滅活MS2噬菌體的效果。 2．二氯異氰尿酸鈉消毒劑滅活MS2噬菌體機(jī)理的研究 2．1 NaDDC消毒劑對(duì)MS2噬菌體核酸影響的研究：采用

4、RT-PCR技術(shù)，使用prime premier軟件設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)blastn比對(duì)以及預(yù)試驗(yàn)檢驗(yàn)引物特異性，觀察消毒劑滅活MS2噬菌體后，其四個(gè)基因是否發(fā)生改變； 2．2 NaDDC消毒劑對(duì)MS2噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白影響的研究：使用透射電鏡觀察消毒劑滅活MS2噬菌體后，病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，病毒對(duì)性菌毛的吸附性是否仍然存在；采用血清中和試驗(yàn)觀察MS2噬菌體經(jīng)二氯異氰尿酸鈉作用后，是否喪失抗原性。方法分別參考相關(guān)文獻(xiàn)，并做改進(jìn)。

5、 結(jié)果： 1.MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性研究 1．1 MS2噬菌體的增殖特性：一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明MS2噬菌體感染宿主菌大腸桿菌ATCC15779的潛伏時(shí)間約為20min，爆發(fā)時(shí)間約為90min，裂解量為77； 1．2 MS2噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)：MS2噬菌體感染其宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)在0.001～0.01之間； 1．3 MS2噬菌體的宿主菌范圍：宿主菌范圍研究中選擇的八種細(xì)菌中，大腸桿菌ATCC

6、15597、大腸桿菌285和大腸桿菌B這三種菌為MS2噬菌體的宿主菌，MS2噬菌體對(duì)這三種宿主菌易感性由高到低順序?yàn)椋捍竽c桿菌ATCC 15597>大腸桿菌285>大腸桿菌B。 1．4 MS2噬菌體對(duì)消毒劑的抵抗力：消毒劑滅活MS2噬菌體結(jié)果如下，300mg/L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用40min，MS2的LIV為2.14Log10；400mg/L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用40min LIV為2.60Log10；

7、500mg/L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用20min LIV可達(dá)到4.39Log10：600mg/L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用5min LIV分別可達(dá)到5.33 Log10；700mg/L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用5min的LIV為>5.80Log10。 2.二氯異氰尿酸鈉消毒劑滅活MS2噬菌體機(jī)理的研究 2.1 NaDDC消毒劑對(duì)MS2噬菌體核酸影響的研究：RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，完全滅活的60

8、0mg/L 10min和800mg/L5min兩個(gè)消毒劑濃度滅活MS2噬菌體后，其四個(gè)基因均被破壞； 2.2 NaDDC消毒劑對(duì)MS2噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白影響的研究：MS2噬菌體被完全滅活后，在電鏡下觀察到，MS2斷裂成直徑約10nm大小的不規(guī)則的圓形碎片，喪失吸附能力，無(wú)法吸附在宿主菌性菌毛上。對(duì)MS2噬菌體抗原性影響的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)：MS2噬菌體被完全滅活后，喪失其抗原性。 結(jié)論： 1.MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性研究

9、 1．1 MS2噬菌體感染宿主菌大腸桿菌ATCC15779的潛伏時(shí)間短； 1．2 最佳感染復(fù)數(shù)在0.001～0.01之間； 1．3 對(duì)宿主菌大腸桿菌ATCC15779的易感性最高； 1．4 二氯異氰尿酸鈉對(duì)MS2噬菌體可起到良好的滅活作用。 2.二氯異氰尿酸鈉消毒劑滅活MS2噬菌體機(jī)理的研究 2．1 二氯異氰尿酸鈉滅活MS2噬菌體后，其四個(gè)基因均被破壞： 2．2 蛋白質(zhì)外殼的形態(tài)發(fā)