補體抑制活性馬勃多糖的純化及結構研究.pdf

1、補體系統(tǒng)(complement system)是對病原體的識別有效地轉化為宿主對最初感染發(fā)揮防御功能的主要機制之一,其活化后完成對病原體的調理、聚集炎癥細胞及形成膜攻擊復合物(MAC)殺死病原體等作用。然而補體系統(tǒng)的非正常激活則會引起人體免疫系統(tǒng)的過度反應,造成正常組織的損傷,且此非正常激活參與多種疾病的病理過程,臨床上目前尚無理想的治療藥物。近年來,本課題組致力于中藥有效成分與補體抑制關系的研究,分離得到一些高效、低毒的小分子及均一的

2、多糖類天然補體抑制物質,初步研究了中藥抗補體活性的物質基礎。本課題主要通過活性導向分離技術,對擔子菌門真菌馬勃的多糖進行了分離純化,對得到的均一多糖進行了初步的理化性質及結構研究,并對其對補體系統(tǒng)的作用進行了靶點的研究。
　　均一多糖的分離純化:馬勃菌體經過醇提后,殘渣經0.02mol/L氫氧化鈉溶液提取,對其提取液進行醇沉,沉淀通過三氯乙酸除去游離蛋白,透析除去小分子后得到總多糖(經典途徑抗補體活性IC50=20.10ug/ml

3、)。總多糖經過DEAE-cellulose柱色譜進行初步分離,以0-2mol/L的氯化鈉洗脫得到5部分,其中水、0.8和2mol/L氯化鈉洗脫部分無活性,0.4mol/L氯化鈉洗脫部分(經典途徑抗補體活性IC50=77.88ug/ml)1.2mol/L氯化鈉洗脫部位(經典途徑抗補體活性IC50=83.24ug/ml)有較好的活性。這兩活性部位通過SephacrylTMS-300及SephacrylTMS-200凝膠柱色譜進一部純化,最終

4、分離出四個具有抗補體活性的均一多糖,命名為TFP-1、TFP-2、TFP-3和TFP-4。
　　均一多糖的抗補體活性測試及作用機理研究:研究了四個均一多糖對補體激活經典和旁路途徑的抑制作用,結果表明:TFP-1、TFP-2、TFP-3和TFP-4在經典途徑的測試中,IC50分別為181.7±14.45ug/ml、132.7±13.70ug/ml、78.81±3.21ug/ml、136.1±11.60ug/ml;在旁路途徑的IC50

5、分別為162.45±23.90ug/ml、142.76±20.70ug/ml、136.23±10.60ug/ml、139.1±11.60ug/ml。從結果可知:四個均一多糖均具有較好的抗補體活性,但較粗多糖已經有較大幅度的降低。通過抗補體靶點的檢測實驗,我們對這四個均一多糖的作用機理進行了初步的研究。這四個均一多糖作用靶點一致,均作用于補體激活途徑中的C1q,C2,C3,C4,C5和C9成分。
　　均一多糖的結構研究:均一多糖TF

6、P-1為棕褐色疏松絮狀,分子量約為500kDa,總糖含量為96.94％;還含有微量的糖醛酸和蛋白質。完全酸水解得到3種單糖,糖基摩爾比為:葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=6.30:1.03:2.07。甲基化結果顯示含Terminal Glcp、1,3-linked Galp、1,2-linked Manp、1,3-linked Glcp、1,6-linked Glcp和1,2,3,6-linked Glcp摩爾比為28.48:

7、10.31:26.69:25.86:8.21:8.25。均一多糖TFP-2亦為棕褐色絮狀,,分子量超過500kDa,總糖含量為97.24％;還含有微量的糖醛酸和蛋白質。完全酸水解得到3種單糖,糖摩爾比為葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=8.68:0.69:0.63。甲基化結果顯示含Terminal Glcp,1,3-linked Galp,1,2-linked Manp,1,3-linked Glcp,1,6-linked Gl

8、cp,1,2,3,6-linked Glcp摩爾比為14.42:6.27:9.71:30.85:34.03:8.75。均一多糖TFP-3為棕黃色絮狀,,分子量約為600kDa,總糖含量為95.24％。完全酸水解得到3種單糖,糖摩爾比為葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=7.46:1.25:1.29。甲基化結果顯示TFP-3含有1,3-linked Galp、1,2-linked Manp、Terminal Glcp、1,3,6-l

9、inked Glcp、1,2,3,6-linked Glcp和1,4-linked GlcpNAC,比例為0.132:0.120:0.402:0.261:0.075。且TFP-3含有約9％ Terminal GlcpA。在結構研究中,結合TFP-3的甲基化結果及它的一維(1H,13C)和二維(HMBC,HMQC,TOCSY)核磁譜圖,實驗對他們的化學位移進行了歸屬并得出了他主要的重復單元是以1,3,6-linked Glcp、1,2,3

10、,6-linked Glcp和1,2-linked Manp為主鏈, Terminal Glcp、Terminal GlcpA和1,3-linked Galp為側鏈的結構。均一多糖TFP-4為淺藍色絮狀,,分子量約為1000kDa,總糖含量為56.94％;糖醛酸含量47.95％,蛋白質含量為34.89％。還原后完全酸水解得到3種單糖組成的,糖殘基摩爾比為:葡萄糖Glc:甘露糖Man:半乳糖Gal=5.886:1.222:2.894,由于