茶樹(shù)花多糖的提取、純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的研究.pdf

1、茶樹(shù)花富含營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì),是一類具重要的潛在資源。本文在系統(tǒng)研究茶葉多糖分離純化、理化性質(zhì)和一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,利用生物大分子研究的近代最新技術(shù)和現(xiàn)代分離、分析手段與藥理實(shí)驗(yàn)方法,表征茶樹(shù)花多糖的溶液行為和三維鏈構(gòu)象,嘗試揭示多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)與其重要生物活性的關(guān)系。
　　 茶樹(shù)花多糖的提取主要包括茶樹(shù)花多糖提取條件的優(yōu)化和茶樹(shù)花多糖脫蛋白,脫色等方法的選擇。采用單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),確定了熱水提取茶

2、樹(shù)花多糖最佳提取條件:21.75倍量水,90℃提取1.89h。通過(guò)綜合考量Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法和氯化鈣法的脫蛋白率和多糖保留量,確定了以Sevag法作為茶樹(shù)花多糖脫蛋白的方法。實(shí)驗(yàn)還比較了活性炭吸附法,H2O2氧化法和溶劑洗滌法的脫色效果,活性炭吸附法能夠得到較高的脫色率和多糖保留量。經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析分離得到多糖組分TFP-1和TFP-2,冷凍干燥后為灰白色粉末,多糖含量為83.6％和87.9％,蛋白

3、含量為1.5％和2.9％,糖醛酸含量為2.7％和7.1％。
　　 高效液相凝膠色譜法分析茶樹(shù)花多糖組分TFP-1和TFP-2,得到TFP-1的分子量為167.5kBa,單糖組成葡萄糖:木糖:鼠李糖:半乳糖=1.0:1.2:0.81:0.98。TFP-2分子量為10.1kDa,單糖組成葡萄糖:木糖:鼠李糖:阿拉伯糖=1.0:0.76:2.3:2.3。多糖的初步分析顯示,TFP-1和TFP-2是水溶性、非淀粉、非酚類物質(zhì),不含還原糖

4、和核酸、含有蛋白質(zhì)的多糖。β-消去反應(yīng)表明TFP-1和TFP-2中糖鏈與蛋白質(zhì)之間通過(guò)0-糖肽鍵相連。通過(guò)紅外光譜分析得出TFP-1和TFP-2具有典型的糖類化合物的光譜特征,TFP-1同時(shí)含有α-吡喃環(huán)以及β-吡喃環(huán)的特征吸收峰,而TFP-2只含有α-吡喃環(huán)的特征吸收峰。1H NMR中的化學(xué)位移顯示TFP-1含有α-D-Galp、α-D-GalpNAc、α-D-Xylpα-D-Glcp和β-D-Glcp殘基。而TFP-2含有αL-Ar

5、ap、α-D-Glcp、α-D-Xylp和α-D-GlcpNAc殘基。
　　 原子力顯微鏡(AFM)的圖像顯示,茶樹(shù)花多糖鏈分子間互相纏繞,在濃度為5μ g／mL下TFP-1和TFP-2直徑為250hm和150hm,在濃度為20μ g／mL時(shí)直徑增加為500nto和200hm。茶樹(shù)花粗多糖TFP及組分TFP-1和TFP-2在水溶液中表現(xiàn)為剪切變稀,在相同的剪切速率下,茶樹(shù)花多糖溶液枯度TFP>TFP-1>TFP-2。通過(guò)激光光散

6、射、粘度測(cè)定和剛果紅反應(yīng)等方法確定了茶樹(shù)花多糖在0.1MNaCl水溶液中呈現(xiàn)球狀構(gòu)象,且分枝較多。pH值、溫度、離子強(qiáng)度等環(huán)境因素的改變均影響其立體構(gòu)象。掃描電鏡SEM觀察和X-射線衍射分析表明TFP-1和TFP-2為無(wú)定形結(jié)構(gòu),提示多糖的空間結(jié)構(gòu)和溶液行為將明顯影響多糖的生物活性。
　　 系統(tǒng)的研究了茶樹(shù)花多糖的體外和體外抗氧化活性。通過(guò)比較茶樹(shù)花粗多糖TFP及組分TFP-1和TFP-2對(duì)羥基自由基,超氧陰離子自由基以及DPP

7、H自由基的清除活性,得出抗氧化活性TFP-2>TFP-1>TFP,這可能與組成多糖的成分及水溶性和粘度有關(guān)。灌胃茶樹(shù)花多糖(75、150和300mg／kg>28d后可抑制溴化苯誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化,能顯著提高小鼠SOD活性和T-AOC水平,并且抑制MDA含量的升高。
　　 灌胃茶樹(shù)花多糖(75、150和300mg／kg)14d后能顯著增加正常小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬活性,對(duì)二硝基甲苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)也有顯著的增強(qiáng)。對(duì)S18

8、0肉瘤小鼠的研究發(fā)現(xiàn),灌胃TFP(75、150和300Mg／kg)7d后能顯著改善荷瘤小鼠生活狀況,顯著增加荷瘤小鼠生存時(shí)間和存活率,抑瘤率分別為45.5％,60.9％和64.5％。能顯著增加荷瘤小鼠血清中IFN-γ和IL-2含量的影響,并且能增加T細(xì)胞亞群CD4+的數(shù)量及改善CD4+／CD8+的失調(diào),提示攝入茶樹(shù)花多糖可明顯增強(qiáng)免疫活性。
　　 茶樹(shù)花多糖對(duì)四氧嘧啶引起的小鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病有明顯的防治作用。灌胃茶樹(shù)花多糖(75、