牙鲆免疫球蛋白單克隆抗體的研制及其在牙鲆淋巴囊腫病研究中的應用.pdf

1、本文在國家自然科學基金項目的資助下，從淋巴囊腫病毒(LCDV)免疫的牙鲆抗血清中分離提取牙鲆免疫球蛋白(Ig)；篩選獲得抗牙鲆Ig的單克隆抗體，并進行了特性分析；應用單克隆抗體研究了牙鲆各組織中表面抗體陽性(SmIg<'+>)細胞的分布；通過檢測牙鲆血清中抗LCDV的特異性抗體水平，初步探討了應用牙鲆Ig的單克隆抗體進行牙鲆淋巴囊腫病的早期診斷及疫苗免疫效果評價的可行性。具體研究結(jié)果如下： (1)牙鲆Ig的分離提取。分離純化LC

2、DV，免疫健康牙鲆，制備抗血清。牙鲆抗血清經(jīng)50％飽和硫酸銨鹽析后，應用AKTA prime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，通過HiTrap Igm Purification Column；HiTrap Protein A Sepharose Column和HiTrapDEAE Sepharose Fast Flow Column三種預裝層析柱純化牙鲆Ig，并進行了分子量的初步測定。結(jié)果表明，HiTrap Igm Putification Column

3、不適合于牙鲆Ig的純化；HiTrap Protein A Sepharose Column可特異性的分離牙鲆Ig，純度高，但產(chǎn)量低；HiTrap DEAE Sepharose Fast Flow Column可分離獲得大量的牙鲆Ig，但混有少量雜蛋白。根據(jù)單抗制備的要求和特點，最后選擇HiTrap DEAE Sepharose FastFlow Column進行牙鲆Ig的大量純化，供單克隆抗體制備使用。通過SDS-PAGE檢測分析得出純

4、化獲得牙鲆Ig的重鏈和輕鏈分子量分別為74kDa和24kDa。 (2)抗牙鲆Ig單克隆抗體的制備及特性分析。以純化的牙鲆Ig為抗原免疫Balb/C小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細胞融合、篩選、有限稀釋法克隆共獲得了10株抗牙鲆Ig的單克隆抗體(2D8、2H1、1E1、1C12、2E6、1E7、1811、4D1、2A7、2E8)?？贵w的亞級份測定結(jié)果表明：單抗2D8，1E1，1C12，2E6，2A7和2E8屬IgG亞型。單抗2H1，1

5、E7，1811和4D1屬IgM亞型。采用Western blot方法對單克隆抗體結(jié)合的抗原決定簇進行了分析，結(jié)果顯示：單抗2D8、2H1，1C12，1E7，1B11，2E6，4D1，2A7和2E8識別的抗原決定簇均位于牙鲆Ig的重鏈(74kDa)上，單抗1E1識別的抗原決定簇同時位于牙鲆Ig的重鏈(74kDa)和輕鏈(24kDa)上，單抗2E6沒有反應條帶。通過間接免疫熒光對牙鲆淋巴細胞表面Ig進行了檢測，結(jié)果表明所制備的10株單抗均能

6、與牙鲆淋巴細胞表面Ig反應。 (3)牙鲆各組織中表面抗體陽性(Smlg<'+>)細胞的分布。應用抗牙鲆Ig的單克隆抗體(2D8)通過流式細胞術(shù)對牙鲆各組織中的smIg<'+>細胞比例進行了分析，發(fā)現(xiàn)各組織中的SmIg<'+>細胞的比例不同，分別為外周血細胞(40.48％)，脾(17.32％)和前腎(9.67％)。 (4)牙鲆血清中抗LCDV特異性抗體水平的檢測。應用抗牙鲆Ig的單克隆抗體(2D8)通過間接ELISA法，檢

7、測了外觀健康無癥狀、患淋巴囊腫病，具明顯腫瘤、患淋巴囊腫病，處于恢復期、免疫接種LCDV滅活疫苗四組牙鲆血清中抗LCDV的特異性抗體水平。結(jié)果表明，無外觀癥狀的牙鲆血清中特異性抗體水平很低(平均OD值為0.092)，個別魚體偏高，推測其已感染LCDV，處于潛伏期，癥狀還未顯現(xiàn)出來；患淋巴囊腫病且癥狀顯現(xiàn)的牙鲆血清中特異性抗體水平升高(平均OD值為0.165)；患淋巴囊腫病后處于恢復期的牙鲆抗體水平更高(平均OD值為0.231)，說明處于