抗豬心肌肌球蛋白單克隆抗體的制備及其在心肌損傷診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、急性心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定心絞痛(UAP)、急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)等心血管疾病引起的心肌損傷是危害人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手,如能早期發(fā)現(xiàn)將對(duì)患者具有重大意義.但由于心肌結(jié)構(gòu)及功能的特殊性,早期心肌損傷的檢測(cè)受到較多的限制,多年來(lái)尋找診斷心肌損傷的各種生化標(biāo)志物及其診斷方法一直是醫(yī)學(xué)工作者努力探索的課題,但至今仍然沒(méi)有一種能夠完全滿足臨床需要的診斷標(biāo)志物和診斷方法.該研究在查閱大量文獻(xiàn)資料和進(jìn)行廣泛的臨床調(diào)查的基礎(chǔ)上,選擇心肌肌球蛋白

2、作為心肌損傷的診斷標(biāo)志物,圍繞抗心肌肌球蛋白單克隆抗體的研制,開(kāi)展了三個(gè)層次的研究工作.抗心肌肌球蛋白單克隆抗體的制備心肌肌球蛋白(Cardiac Myosin,CM)用于心肌損傷的診斷,較心電圖和其它血清酶或肌紅蛋白更敏感和特異.在心肌受到損傷或酸性pH時(shí),由心肌肌球蛋白構(gòu)成的粗肌絲發(fā)生裂解,CM輕鏈(CMLC)和重鏈(CMHC)釋放入血,CMLC出現(xiàn)早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),CMHC的結(jié)構(gòu)特征決定其具有良好的特異性,所以心肌肌球蛋白的測(cè)定是迄

3、今為止診斷心肌損傷和研究心肌損傷及保護(hù)較特異的生化指標(biāo),可用于AMI的早期診斷和后期治療觀察.由于豬與人的CM氨基酸序列存在99％以上的同源性,而人類(lèi)心肌肌球蛋白抗原難以獲得,所以我們采用豬CM代替人CM作為抗原免疫小鼠,經(jīng)過(guò)七次融合,采取間接ELISA方法,從3000多個(gè)孔中篩選出14株,分別來(lái)自5個(gè)不同融和孔的能穩(wěn)定分泌高效價(jià)的抗豬心肌肌球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株.生物學(xué)初步鑒定結(jié)果顯示,制得的單克隆抗體具有親和力高,特異性強(qiáng)等

4、特點(diǎn).為下一步診斷方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ).心肌肌球蛋白雙抗體夾心ELISA法的建立及初步應(yīng)用用制備的抗CM的單克隆抗體作為第一抗體包被酶標(biāo)板,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗CM多肽抗體作為第二抗體,初步建立了雙抗體夾心ELISA法,對(duì)血清中的心肌肌球蛋白可進(jìn)行定性、定量地檢測(cè),利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其最小檢測(cè)下限為0.3ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.0~20.0ng/ml范圍內(nèi)線性良好.初步應(yīng)用于檢測(cè)30例急性心肌急性心肌梗塞患者血清中CM水平,并與

5、肌鈣蛋白膠體金免疫層析試劑卡同期比較,表明兩種方法的符合率為84.8％,并具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.心肌肌球蛋白膠體金免疫層析診斷方法的建立及初步應(yīng)用成功制備了性能穩(wěn)定、免疫學(xué)活性好的金標(biāo)CM多肽抗體,將其固定于玻璃纖維膜上作為顯色源;抗CM單克隆抗體結(jié)合于硝酸纖維素膜上作為捕獲抗體,制成免疫層析試紙條.該試紙條的檢測(cè)靈敏度可達(dá)5ng/ml.撿測(cè)30例急性心肌梗塞患者血清CM水平,并與Roche肌鈣蛋白膠體金免疫層析試劑卡比較,符合率達(dá)