雙水相萃取分離免疫球蛋白和單克隆抗體研究.pdf

1、抗體廣泛用于疾病治療、醫(yī)療診斷和免疫分離，具有廣闊的市場需求和發(fā)展前景?？贵w主要從動物血液、腹水和細(xì)胞培養(yǎng)液中分離得到，尤其是動物細(xì)胞培養(yǎng)制備單克隆抗體，已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。然而，目前抗體分離過程的成本仍舊較高，成為抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個瓶頸，開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的抗體分離新方法，具有重要意義。雙水相萃取具有生物相容性好、分離條件溫和、成本相對較低、易于放大等優(yōu)點(diǎn)，本文針對含人血清白蛋白(HSA)料液中分離免疫球蛋白G(IgG)和細(xì)胞培養(yǎng)液中分離單克

2、隆抗體兩類典型的抗體分離過程，探討雙水相萃取分離抗體的可行性。主要內(nèi)容如下:
　　(1)從含有HSA的混合蛋白中雙水相萃取分離IgG。比較分析了不同類型雙水相系統(tǒng)中IgG的分配情況，選擇聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉(HPS)為合適的雙水相系統(tǒng)?？疾炝薖EG濃度、HPS濃度、NaCl濃度和pH對IgG和HSA在PEG/HPS系統(tǒng)中分配的影響，以IgG上相收率(Ytop)和純化因子(PF)為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法評價了四個因素的顯著性

3、，并優(yōu)化了萃取條件，確定最佳分離條件是12％PEG、18％HPS、10％NaCl和pH8.0，Ytop為99.2％，PF為5.28。進(jìn)一步考察了PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)反萃取IgG，確定反萃取最適條件為磷酸鹽(pH7)濃度10％，第一步萃取的上相量與磷酸鹽母液(40％，w/w)的質(zhì)量比為1.6∶1。經(jīng)萃取和反萃取兩步分離，IgG收率為84.0％，純化因子為5.73，實(shí)現(xiàn)了從含HSA料液中高效分離IgG。
　　(2)探討了NaCl對

4、IgG在雙水相系統(tǒng)中分配和溶解性影響的作用機(jī)制。首先考察了NaCl對IgG分配的影響機(jī)制，發(fā)現(xiàn)添加NaCl造成PEG/HPS雙水相系統(tǒng)相圖的雙節(jié)點(diǎn)曲線向偏離坐標(biāo)原點(diǎn)方向移動，兩相間的疏水差異性增大;利用熒光法測定了NaCl對IgG疏水性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度增大，IgG分子疏水性增大，這正是IgG選擇性分配至上相的主要原因。其次考察了添加NaCl對IgG溶解性的影響，發(fā)現(xiàn)添加NaCI加劇了IgG在(NH4)2SO4溶液中沉淀析出，

5、卻增大了IgG在PEG溶液中的溶解性，解釋了PEG/(NH4)2SO4和PEG/HPS雙水相系統(tǒng)中IgG收率的差異。進(jìn)一步采用等溫滴定量熱法分析了NaCl對IgG-PEG間相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)隨NaCI濃度增大，IgG-PEG間的相互作用方式發(fā)生了改變，高NaCl濃度下IgG-PEG間疏水相互作用增強(qiáng)，明確了添加NaCl增大IgG在PEG溶液中溶解性的內(nèi)在原因，并提出了NaCl影響的可能機(jī)制。
　　(3)采用兩步雙水相萃取法從中國

6、倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng)液中分離單克隆抗體MAB。考察了PEG/HPS雙水相系統(tǒng)萃取分離MAB，優(yōu)化了NaCl添加量、pH和料液添加量，確定了最佳條件為12％PEG、18％HPS,15％NaCl,pH6.0和6％CHO細(xì)胞培養(yǎng)液，MAB收率和純度達(dá)96.7％和96.0％。采用PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)反萃取，得到合適的分離條件為系統(tǒng)中磷酸鹽濃度為8％，第一步萃取的上相量與磷酸鹽母液的質(zhì)量比為2.5∶1。經(jīng)兩步萃取，MAB收率和純度分

7、別為86.8±1.0％和97.6±0.5％。比較了雙水相萃取和ProteinA親和層析，發(fā)現(xiàn)二者得到的MAB純度相近，表明雙水相萃取可作為ProteinA親和層析的潛在替代方法，用于從細(xì)胞培養(yǎng)液中高效分離單克隆抗體。
　　(4)探討了混合模式配基雙水相系統(tǒng)分離抗體的可行性。首先實(shí)現(xiàn)了PEG分子與配基的高效偶聯(lián)，制備了系列配基-PEG。采用環(huán)氧氯丙烷法活化PEG，環(huán)氧基接入量可達(dá)到460μmol·g-1PEG;再將活化PEG與配基偶

8、聯(lián)，配基接入率達(dá)到90％以上。考察了混合模式配基對IgG在雙水相系統(tǒng)中分配的影響，包括疏水型配基(MMI-PEG)和荷電配基（MBA-PEG,AHNSA-PEG,MBIA-PEG和MBIS-PEG）。比較分析后發(fā)現(xiàn)巰基咪唑苯甲酸(MBIA)較合適，當(dāng)pH5.0時，添加MBIA-PEG可使IgG富集于上相而大部分HSA分配在下相中。結(jié)果表明，混合模式配基雙水相系統(tǒng)分離IgG具有一定可行性，相關(guān)系統(tǒng)研究還需進(jìn)一步開展。
　　綜上所述，