粘附分子和JNK信號(hào)在胸主動(dòng)脈瘤形成過(guò)程中的作用機(jī)制.pdf

1、前言：胸主動(dòng)脈瘤是一種常見(jiàn)的潛在的致命性血管外科疾病,因發(fā)病兇險(xiǎn),死亡率高,嚴(yán)重威脅人民群眾生命健康,因此對(duì)該病的研究具有極其重要的臨床和社會(huì)價(jià)值。
　　 主動(dòng)脈瘤是一種多因素疾病,受細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)的雙重調(diào)控,是血管壁細(xì)胞種類(lèi)和數(shù)量改變以及細(xì)胞外基質(zhì)病理性重塑的結(jié)果。主要病理學(xué)改變包括:動(dòng)脈壁慢性透壁炎癥、中膜平滑肌細(xì)胞缺失、膠原蛋白和彈力蛋白減少。
　　 炎癥在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。動(dòng)脈瘤或

2、動(dòng)脈粥樣硬化均有白細(xì)胞的浸潤(rùn),特別是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞,進(jìn)而引起免疫反應(yīng)和血管病變。浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞釋放許多的炎癥因子,同時(shí)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。目前,有數(shù)種分子在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中粘附分子,包括VCAM-1和ICAM-1,在炎癥細(xì)胞募集過(guò)程中發(fā)揮重要作用。他們?cè)谘装Y反應(yīng)中與白細(xì)胞的黏附,滾動(dòng)和跨內(nèi)皮遷移相關(guān)聯(lián)。免疫球蛋白樣分子ICAM-1在正常內(nèi)皮細(xì)胞呈弱表達(dá),而在暴露于炎癥因子的情況下,其表達(dá)迅速升高。在白細(xì)胞的聚集和黏

3、附過(guò)程中,VCAM-1主要通過(guò)與單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上的反配體VLA-4相作用。MCP-1屬于CC趨化因子家族,是單核細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞,自然殺傷細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞潛在的激動(dòng)劑。然而,關(guān)于近段胸主動(dòng)脈炎癥疾病的研究很少,充分揭示炎癥分子對(duì)動(dòng)脈瘤成瘤的作用,對(duì)胸主動(dòng)脈瘤的治療是很關(guān)鍵的。
　　 C-Jun氨基末端激酶(JNK),是炎癥初期的信號(hào)分子,臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其與腹主動(dòng)脈瘤和腦動(dòng)脈瘤的擴(kuò)張相關(guān)。盡管已知JNK參與腹主動(dòng)脈瘤的形成

4、,但由于胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈來(lái)自不同的胚層,二者動(dòng)脈瘤發(fā)生的機(jī)制也有可能不同,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究活化的JNK通路在胸主動(dòng)脈瘤的表達(dá),進(jìn)一步明確胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制。
　　 姜黃素是從姜科植物中提取的一種相對(duì)分子量小的多酚類(lèi)物質(zhì)。大量研究證明,姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗血栓、抗癌、清除自由基等作用?？诜S素可以抑制實(shí)驗(yàn)性小鼠腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展。最近有研究報(bào)道,姜黃素對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞的JNK磷酸化有抑制作用,進(jìn)而遏制了JNK

5、磷酸化導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。然而,姜黃素是否可通過(guò)拮抗胸主動(dòng)脈瘤的JNK信號(hào),從而減少胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡、阻斷胸主動(dòng)脈瘤的成瘤通路,國(guó)內(nèi)外迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 因此本項(xiàng)研究分三方面:
　　 1.通過(guò)檢測(cè)促炎性細(xì)胞遷移的MCP-1和粘附分子在早期胸主動(dòng)脈瘤的表達(dá),進(jìn)一步闡釋炎癥信號(hào)在胸主動(dòng)脈瘤的形成過(guò)程中的作用。
　　 2.通過(guò)探索胸主動(dòng)脈瘤模型大鼠體內(nèi)JNK信號(hào)的變化規(guī)律和JNK對(duì)細(xì)胞基質(zhì)合成和平滑肌細(xì)胞凋亡

6、的調(diào)控特點(diǎn),闡明JNK信號(hào)通路在胸主動(dòng)脈瘤成瘤過(guò)程中的作用。
　　 3.通過(guò)用姜黃素拮抗JNK通路對(duì)胸主動(dòng)脈瘤進(jìn)行治療,評(píng)價(jià)姜黃素的血管保護(hù)作用,闡釋姜黃素對(duì)動(dòng)脈瘤的治療機(jī)制。研究的結(jié)果為闡述胸主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制和逆轉(zhuǎn)方法提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分:采用大鼠升主動(dòng)脈狹窄后擴(kuò)張動(dòng)物模型為研究對(duì)象。應(yīng)用超聲檢測(cè)儀和SZH立體顯微鏡觀察主動(dòng)脈管徑的變化；應(yīng)用組織學(xué)方法、掃描電鏡、免疫組織化學(xué)技術(shù)、及明膠

7、酶譜分析技術(shù)檢測(cè)胸主動(dòng)脈瘤形成早期介導(dǎo)炎性細(xì)胞遷移的粘附分子和MMP的表達(dá)改變。
　　 第二部分:采用胸主動(dòng)脈周?chē)舐然}誘導(dǎo)的胸主動(dòng)脈瘤模型為研究對(duì)象,應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)人及大鼠胸主動(dòng)脈瘤炎癥上游信號(hào)JNK通路改變。應(yīng)用SZH立體顯微鏡檢測(cè)動(dòng)脈管徑變化;地衣紅和茜素紅染色觀察動(dòng)脈結(jié)構(gòu)改變；采用western blot技術(shù)、TUNEL技術(shù)檢測(cè)姜黃素對(duì)胸主動(dòng)脈瘤JNK信號(hào)通路的抑制及對(duì)動(dòng)脈壁細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：

8、
　　 一、MCP-1,VCAM-1和ICAM-1在動(dòng)脈瘤擴(kuò)張?jiān)缙诘谋磉_(dá)
　　 1、Wistar大鼠擴(kuò)張升主動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)改變
　　 (1)動(dòng)脈管徑改變術(shù)后8周,正常升主動(dòng)脈無(wú)擴(kuò)張,呈光滑圓管狀,動(dòng)脈瘤可見(jiàn)明顯的動(dòng)脈擴(kuò)張。動(dòng)脈瘤組動(dòng)脈管徑較對(duì)照組管徑增長(zhǎng)44.26％(對(duì)照組2.35±0.05 mm,動(dòng)脈瘤組3.39±0.15 mm,p＜0.05)。
　　 (2)動(dòng)脈瘤壁組織學(xué)改變HE染色可見(jiàn)主動(dòng)脈瘤壁的結(jié)構(gòu)

9、紊亂,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Romeis地依紅染色可見(jiàn)正常升主動(dòng)脈壁的彈力板排列規(guī)則、緊密,彈力板呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài);升主動(dòng)脈瘤壁的彈力板排列混亂、各層之間間隔增大,并有斷裂現(xiàn)象。有時(shí)斷裂部位有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 2、CD45,MCP-1,ICAM-1和VCAM-1在動(dòng)脈瘤的表達(dá)
　　 (1)正常動(dòng)脈管壁CD45陽(yáng)性細(xì)胞僅在血管壁內(nèi)膜有少量表達(dá)；相反,動(dòng)脈瘤管壁的全層均可見(jiàn)CD45陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 (2)MCP-1,

10、ICAM-1和VCAM-1在正常升主動(dòng)脈僅有少量表達(dá),動(dòng)脈瘤MCP-1表達(dá)明顯增強(qiáng),主要定位于管壁內(nèi)膜。VCAM-1主要定位于動(dòng)脈瘤管壁內(nèi)膜增厚的內(nèi)皮細(xì)胞層。ICAM-1集中定位于動(dòng)脈瘤管壁內(nèi)皮,同時(shí)在中膜和外膜有大量散在的陽(yáng)性染色。動(dòng)脈瘤管壁MCP-1,ICAM-1和VCAM-1平均光密度較對(duì)照組顯著升高。
　　 3、MMP-2和MMP-9的表達(dá)正常動(dòng)脈壁中的明膠酶活性很低,沒(méi)有顯示出降解條帶;動(dòng)脈瘤時(shí)動(dòng)脈壁中MMP-2、MM

11、P-9的活性和表達(dá)較正常動(dòng)脈顯著升高。
　　 二、JNK信號(hào)在胸主動(dòng)脈瘤形成中的機(jī)制
　　 1、胸主動(dòng)脈瘤JNK信號(hào)表達(dá)人胸主動(dòng)脈瘤組織p-JNK高表達(dá),主要位于中膜,外膜少量表達(dá)。對(duì)Wistar大鼠胸主動(dòng)脈瘤模型的JNK及其下游底物p-c-jun進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈瘤的p-JNK和p-c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞較正常動(dòng)脈明顯增多。
　　 2、姜黃素對(duì)動(dòng)脈瘤管徑的影響正常胸主動(dòng)脈無(wú)擴(kuò)張,氯化鈣處理的胸主動(dòng)脈顯著擴(kuò)張,形成動(dòng)

12、脈瘤。而姜黃素治療組胸主動(dòng)脈擴(kuò)張程度較胸主動(dòng)脈瘤組明顯降低,幾乎接近正常動(dòng)脈管徑的水平。
　　 3、姜黃素對(duì)動(dòng)脈瘤管壁彈力板和鈣沉積的影響(1)動(dòng)脈瘤組動(dòng)脈壁的彈力板較正常動(dòng)脈的層數(shù)減少、變得平直。而用姜黃素治療組,動(dòng)脈壁的彈力板層數(shù)目較動(dòng)脈瘤組明顯增多。形態(tài)上也同正常動(dòng)脈相似,呈波浪型膜狀。(2)茜素紅染色可見(jiàn)應(yīng)用氯化鈣處理的動(dòng)脈壁周?chē)写罅库}的沉積,在動(dòng)脈壁鈣沉積的部位血管呈現(xiàn)出局部擴(kuò)張明顯,而姜黃素組動(dòng)脈周?chē)鷰缀鯖](méi)有鈣的沉

13、積。
　　 4、姜黃素對(duì)JNK信號(hào)的抑制作用正常主動(dòng)脈壁p-JNK僅有少量表達(dá),而在動(dòng)脈瘤壁中顯著升高。用姜黃素治療后由于下調(diào)了p-JNK的表達(dá),使p-JNK的表達(dá)水平與正常水平接近。同時(shí)JNK的下游底物p-c-jun與p-JNK表達(dá)的結(jié)果相一致。動(dòng)脈瘤壁中p-c-jun較正常動(dòng)脈升高,姜黃素治療組則明顯下調(diào)p-c-jun的表達(dá)。
　　 5、姜黃素對(duì)動(dòng)脈瘤管壁的細(xì)胞凋亡影響正常動(dòng)脈壁幾乎沒(méi)有凋亡細(xì)胞存在,用CaCl2造模

14、的動(dòng)脈瘤組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多,表明有顯著的動(dòng)脈瘤壁平滑肌細(xì)胞凋亡。用姜黃素治療組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)率較動(dòng)脈瘤組顯著降低。證明姜黃素可顯著降低動(dòng)脈瘤管壁的細(xì)胞凋亡。
　　 6、姜黃素對(duì)bcl-2,baX和caspase-3表達(dá)水平的影響
　　 (1)隨凋亡的增加,動(dòng)脈瘤組伴出現(xiàn)bax表達(dá)升高,bcl-2表達(dá)降低,bcl-2/bax的比值較正常組下降現(xiàn)象。
　　 (2)與動(dòng)脈瘤組相比,姜黃素治療組則上調(diào)了bc

15、l-2/bax的比值。
　　 (3)檢測(cè)結(jié)果證明caspase-3在動(dòng)脈瘤組也呈現(xiàn)明顯的高表達(dá),而應(yīng)用姜黃素治療后,其表達(dá)水平也顯著降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,MMPs的表達(dá)及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)與胸主動(dòng)脈瘤早期擴(kuò)張相關(guān),這些炎癥因子在動(dòng)脈擴(kuò)張?jiān)缙诎l(fā)揮重要作用,這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明炎癥因子確實(shí)參與胸主動(dòng)脈瘤的成瘤過(guò)程。
　　 2、JNK信號(hào)在動(dòng)脈瘤細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和平滑肌