海帶(Saccharina japonica)褐藻膠合成途徑若干基因的克隆、表達(dá)以及功能驗(yàn)證.pdf

1、褐藻膠作為褐藻細(xì)胞壁的特征性組分,具有多種生物活性,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和紡織等多個(gè)行業(yè)。相對(duì)假單胞菌屬和固氮菌屬微生物而言,褐藻的褐藻膠生物合成途徑尚不明確,研究其合成通路基因的結(jié)構(gòu)與功能,不僅對(duì)于研究褐藻綱的系統(tǒng)進(jìn)化具有重要的科學(xué)意義,同時(shí)也將為分子輔助育種、基因工程等研究提供必要的功能基因研究基礎(chǔ)。
　　本論文利用生物信息學(xué)方法,對(duì)“國際千種植物轉(zhuǎn)錄組計(jì)劃”數(shù)據(jù)庫和海帶基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和注釋,對(duì)褐藻膠生物膠合成途徑的基因

2、(PMI、PMM、MPG、algD和algG)進(jìn)行了候選基因的同源性、結(jié)構(gòu)域、三維結(jié)構(gòu)等分析,初步完成了對(duì)其基因功能的預(yù)測,基本構(gòu)建完成了海帶等的褐藻膠生物合成途徑;通過研究褐藻膠合成途徑基因的拷貝數(shù)變化、多基因家族特殊的基因排布方式以及基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等,探討了藻類褐藻膠合成通路基因的進(jìn)化起源和多基因家族的適應(yīng)性變異和演化過程。結(jié)果顯示:海帶等褐藻的褐藻膠合成途徑與微生物基本一致,但其第一步反應(yīng)(可逆性催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6

3、-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化)和第三步反應(yīng)(可逆性催化甘露糖-1-磷酸和GDP-甘露糖之間的相互轉(zhuǎn)化)的酶則由Type I類型雙功能PMI基因(同時(shí)具有PMI和MPG活性)編碼;褐藻膠合成通路中前體物質(zhì)GDP-甘露糖醛酸合成基因的拷貝數(shù)較少(海帶中PMI基因?yàn)?個(gè)拷貝、PMM基因?yàn)閱慰截悺lgD基因?yàn)?個(gè)拷貝),但是其異構(gòu)化修飾基因(algG)拷貝數(shù)眾多以超大基因家族形式存在(海帶有78個(gè)成員),且海帶基因組中多拷貝基因 algG基因的數(shù)目明

4、顯多于長囊水云(海帶中algG基因成員數(shù)是水云algG基因的約三倍)。
　　本論文首次完成了海帶褐藻膠生物合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆(Sja-PMM基因和Sja-algG基因),并對(duì)比研究了Sja-PMM和Sja-PMI4的酶學(xué)性質(zhì)。原核表達(dá)后獲得Sja-PMM重組蛋白,大小為48 KDa,濃度為0.97 mg/ml,酶活性檢測顯示其同時(shí)具有磷酸甘露糖變位酶(PMM)和磷酸葡萄糖變位酶(PGM)活性,是一個(gè)雙功能的底物非特異性蛋白;

5、該蛋白的PMM和PGM活性的最適宜溫度分別為25℃和30℃,最適緩沖液pH分別為7.4和7.0,酸性環(huán)境抑制酶活性,而堿性環(huán)境(緩沖液pH大于9.0)中酶活性幾乎完全喪失;Mg2+和Co2+可極其顯著促進(jìn)PMM活性和PGM活性,Zn2+抑制PMM活性,其他金屬離子(Ca2+, Cu2+, Cd2+和 Pb2+)則對(duì)兩種活性均無顯著影響;重組蛋白Sja-PMM的PMM活性顯著高于其PGM活性,以甘露糖-1-磷酸作為底物,Vmax為58.8

6、2 U/mg,Km為699.41μM,Kcat/Km為0.0672 s-1μM-1,以葡萄糖-1-磷酸為底物,Vmax為6.45 U/mg,Km為41.04μM,Kcat/Km為0.125 s-1μM-1。
　　酶學(xué)性質(zhì)檢測結(jié)果顯示,Sja-PMI4重組蛋白屬于Type I類型的雙功能PMI蛋白,相比較其微弱的PMI活性,Sja-PMI4重組蛋白具有顯著的MPG活性,其MPG活性最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃和7.0。不同金屬離子

7、對(duì)MPG活性的促進(jìn)作用順序?yàn)镸n2+>Mg2+>Ca2+>Cu2+,Zn2+顯著性抑制MPG活性;酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別為Vmax為3.28 U/mg,Km為32.44 mM,Kcat/Km為1.12 s-1mM-1。
　　對(duì)藻類褐藻膠途徑同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示褐藻中的algD和algG基因可能起源于細(xì)菌的基因水平轉(zhuǎn)移,而PMI和PMM基因可能起源于質(zhì)體的二次內(nèi)共生事件;海帶和長囊水云中PMI基因都為3個(gè)拷貝,而Sja-P

8、MI4功能驗(yàn)證結(jié)果顯示,其MPG的功能可能源于基因復(fù)制后的新功能進(jìn)化。褐藻膠合成的差向異構(gòu)修飾基因(algG基因)在海帶和長囊水云等褐藻基因組中存在多拷貝和基因串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象,algG基因家族可根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果大致分為五個(gè)類型,其形成可能源于基因復(fù)制事件,其多拷貝以及內(nèi)含子分布的差異特征顯示可能存在著不同的調(diào)控方式;algG基因催化甘露糖醛酸向古洛糖醛酸的變構(gòu),能夠提高褐藻膠的強(qiáng)度進(jìn)而影響到藻體的柔韌程度,與藻類對(duì)潮汐、海流等生態(tài)環(huán)境的適