煙草茄尼醇合成途徑中dxps基因的克隆與表達.pdf

1、茄尼醇是植物次生代謝產物中的一種萜類物質，由于本身具有藥用價值，且是輔酶Q10的關鍵中間體，越來越受到人們的關注。茄尼醇廣泛存在于植物中，但含量甚微，其中桑葉、馬鈴薯葉、煙葉中的含量較高，煙葉中含量最高。茄尼醇在國際市場上供不應求。
　　 煙草中茄尼醇的合成前提物異戊二烯焦磷酸主要來源于丙酮酸-3-磷酸甘油醛途徑，脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXPS)是其途徑中的關鍵酶。有實驗表明，抑制脫氧木酮糖-5-磷酸合酶的合成可以減少其次生

2、代謝產物的含量。而導入外源的dxps基因則可增加該途徑中萜類物質的含量。發(fā)狀根具有生長快、不需外源性生長激素、次生代謝物含量高和遺傳特性穩(wěn)定等，常被用來做生產次生代謝物的生物反應器。因此，通過基因工程和細胞培養(yǎng)相結合的方法探討提高茄尼醇含量的方法具有一定的研究意義。通過導入外源dxps基因，促使DXPS過量表達，再通過對發(fā)根的培養(yǎng)，從兩個方面提高茄尼醇的產量。具體方法如下：
　　 1.目的基因的獲得：提取擬南芥的總RNA，設計引

3、物，進行RT-PCR，獲得目的基因dxps，與中間載體pMD19相連，在大腸桿菌內進行轉化，復制，測序。
　　 2.表達載體的構建：重新設計帶有酶切位點的引物，與pMD19分子連接，大腸桿菌轉化，復制；酶切，檢測，與pBI121載體相連，構建好pBI121-pMD19dxps載體。通過凍融法轉入A4發(fā)根農桿菌中。
　　 3.煙草發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)的建立：通過研究影響誘導發(fā)狀根的各種因素，確定最佳的轉化材料和轉化條件，建立高效的