海蜇Wnt信號途徑關鍵節(jié)點基因的克隆與表達.pdf

1、本文采用轉錄組454 GS FLX測序和RACE技術,篩選和克隆海蜇(Rhopilema esculentum)Wnt信號途徑關鍵節(jié)點基因的cDNA和基因組,利用熒光實時定量PCR和整體原位雜交技術分析這些基因在海蜇無性繁殖階段的表達和分布規(guī)律,探討它們在海蜇無性繁殖過程中的調控作用。
　　1.首次解析了海蜇Wnt4基因的cDNA和基因組結構:Re-Wnt4基因的cDNA全長1212 bp,其中編碼區(qū)長1032 bp,編碼了343

2、個氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Wnt4具有Wnt家族共同的結構特征,包括一個由28個氨基酸組成的信號肽和一個由24半胱氨酸殘基組成的Wnt4結構域。Blast分析表明,Re-Wnt4基因與海膽、囊舌蟲和人的Wnt4具有高度相似性?；卩徑臃嫿╓nt4的系統(tǒng)進化樹揭示,在由人、斑馬魚Wnt家族所有成員構建的12 Wnt亞家族系統(tǒng)樹中,Re-Wnt4基因與人和斑馬魚的Wnt4聚類成一支。Re-Wnt4基因組含有3個外顯子和2個

3、內含子,與已獲得的其它動物的Wnt4基因組相比較發(fā)現(xiàn),Re-Wnt4的基因組最小,結構差異明顯。實時熒光定量PCR顯示,Re-Wnt4基因在海蜇的螅狀體、橫裂體、碟狀體和稚水母四個發(fā)育階段均有表達,但存在著明顯的發(fā)育表達差異,其中橫裂體階段的表達量最高,分別是螅狀體、碟狀體和稚水母表達量的5.75、3.06和2.76倍。
　　2.首次解析了海蜇 Wnt5基因的cDNA和基因組結構:Re-Wnt5基因的cDNA全長1647 bp,其

4、中編碼區(qū)長1059 bp,編碼了353個氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Wnt5具有Wnt家族共同的結構特征,包括一個由20個氨基酸組成的信號肽,2個 N-糖基化位點和24個保守的參與二硫鍵形成的半胱氨酸。Blast分析表明,Re-Wnt5基因與來自刺胞動物、無脊椎動物和脊索動物的Wnt5、脊椎動物的Wnt5a和Wnt5b具有高度相似性?；卩徑臃嫿╓nt5的系統(tǒng)進化樹揭示,來自刺胞動物門不同物種的Wnt5首先聚類為一支,在脊

5、索動物文昌魚Wnt5之后,Wnt5a和Wnt5b產(chǎn)生分歧,形成了兩個進化分支。Wnt5基因的起源可能是伴隨多細胞動物祖先形成過程產(chǎn)生的, Wnt5a和Wnt5b兩個進化分支發(fā)生在脊索動物文昌魚之后。Re-Wnt5基因組含有4個外顯子和3個內含子,結構與刺胞動物的Wnt5、脊椎動物 Wnt5a和 Wnt5b的基因組相似;但總長度僅類似于刺胞動物的Wnt5,明顯小于脊椎動物Wnt5a和Wnt5b。實時熒光定量PCR顯示, Re-Wnt5基因

6、在海蜇的螅狀體、橫裂體、碟狀體和稚水母四個發(fā)育階段均有表達,但存在著明顯的發(fā)育表達差異,其中橫裂體階段的表達量最高,分別是螅狀體、碟狀體和稚水母表達量的12.38、9.99和13.01倍,而表達量最低的發(fā)育階段是碟狀體階段。
　　3.首次解析了海蜇Frizzled1基因的cDNA和基因組結構:ReFzd-1基因的全長cDNA為2387 bp,其中編碼區(qū)為1761bp,編碼586個氨基酸的多肽。SMART分析表明,ReFzd-1基因

7、具備Frizzled家族共同的結構特征,包括:一個由23個氨基酸組成的信號肽,一個含有10個保守的半胱氨酸殘基的半胱氨酸富集域(CRD)以及由七個跨膜蛋白組成的跨膜區(qū)。Blast分析表明,ReFzd-1基因與來自刺胞動物的貝螅H. echinata、水螅H. vulgaris、半球美螅水母C. hemisphaerica和海葵N. vectensis具有高度相似性,與人H. sapiens,鼠M. musculus,爪蟾X. laevi

8、s和斑馬魚 D. rerio的Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7具有較高的同源性。利用N-J法將人、鼠爪蟾、斑馬魚和果蠅所有Frizzled家族基因構建系統(tǒng)樹顯示,所有Frizzled家族成員聚類成11個亞家族,進一步可劃分成4個類群,海蜇ReFzd-1基因與刺胞動物門的Frizzled聚類在一起,然后與Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7三個亞家族聚成一個類群。采用熒光定量RT-PCR結果

9、顯示,ReFzd-1基因在海蜇無性繁殖的四個發(fā)育階段螅狀體、橫裂體、碟狀體和稚水母均有表達,其中橫裂體階段表達量最高,水母體階段表達量最低。ReFzd-1基因在海蜇內胚層的表達高于其在外胚層的表達量,前者是后者的5倍。整體原位雜交結果顯示,在海蜇橫裂體階段,ReFzd-1主要表達在橫裂體的基盤和觸手,發(fā)生橫裂的部位也高度表達。
　　上述研究結果表明,海蜇Wnt信號調控途徑的三個關鍵節(jié)點基因Wnt4、Wnt5和Frizzled1參與