不同齲敏感人群變形鏈球菌產(chǎn)酸耐酸毒力因子遺傳多態(tài)性研究.pdf

1、齲病是危害人類口腔健康的主要疾病，是一種牙菌斑生物膜依賴性疾病。血清c型變形鏈球菌(Streptococcusmutans，簡稱S.mutans，變鏈菌)是牙菌斑生物膜中主要定植菌之一，也是最重要的致齲菌。變鏈菌的致齲作用包括菌細(xì)胞的粘附、產(chǎn)酸和耐酸三個環(huán)節(jié)。在牙菌斑中變鏈菌依靠酵解糖類生存，酵解產(chǎn)物有機(jī)酸特別是乳酸導(dǎo)致環(huán)境pH降低，引起釉質(zhì)脫礦發(fā)生齲??；同時(shí)，為了適應(yīng)在低pH下生存和持續(xù)產(chǎn)酸，菌細(xì)胞必須維持一個相對中性的胞內(nèi)環(huán)境，這主

2、要通過菌細(xì)胞的耐酸能力得以實(shí)現(xiàn)，即酸適應(yīng)性或耐酸性，故產(chǎn)酸和耐酸是變鏈菌致齲必備的兩大生理特征。乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，簡稱LDH)是致齲菌合成乳酸的關(guān)鍵酶，而質(zhì)子移位膜ATP酶(membrane-boundproton-translocatingATPase，F(xiàn)0F1ATPase，簡稱F-ATPase)是菌細(xì)胞耐酸力的最主要調(diào)節(jié)機(jī)制，因此，LDH和F-ATPase是變鏈菌的重要產(chǎn)酸耐酸因子，在齲病的發(fā)生發(fā)

3、展中發(fā)揮重要的毒力作用。 變鏈菌不同菌株的致齲毒力存在差異，毒力因子的基因變異是決定這種差異的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。變鏈菌多態(tài)性研究近年來受到普遍關(guān)注，諸多研究證實(shí)全菌DNA和毒力因子DNA在不同菌株之間確實(shí)存在遺傳多態(tài)性。本課題組前期已對不同齲敏感人群的變鏈菌細(xì)胞組DNA多態(tài)性、粘附因子表面蛋白P1和葡2糖基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與細(xì)菌粘附毒力及齲病發(fā)生的關(guān)系，以及菌株多項(xiàng)致齲毒力進(jìn)行了系列研究，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對LDH和F-ATPase

4、的遺傳多態(tài)性及其與細(xì)菌產(chǎn)酸耐酸能力之間的關(guān)系作系統(tǒng)探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1.LDH不同酶活性菌株在高齲和無齲人群的分布不同，變鏈菌LDH活性與齲病的發(fā)生有一定相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)所用的考馬斯亮藍(lán)蛋白定量結(jié)合還原性輔酶Ⅰ氧化法適于初步定量評價(jià)酶活性和菌株篩選。LDH結(jié)構(gòu)基因ldh表現(xiàn)MseI-RFLP基因型多態(tài)，不同基因型菌株在不同酶活性組的分布不同，提示乳酸脫氫酶基因多態(tài)性與酶活性差異相關(guān)；半定量RT—PCR發(fā)現(xiàn)兩種基因型ldh的mRNA表

5、達(dá)水平亦不同，B型ldh及低酶活性的菌株基因表達(dá)上調(diào)。 2.變鏈菌臨床株F-ATPase的F0主要功能亞基c、a、b的聯(lián)合基因uncEBF行ALuⅠ-RFLP和DdeⅠ-RFLP分析出現(xiàn)A、B、C、D四種基因型且分布不同，高耐酸性菌株中A型基因uncEBF的檢出高于低耐酸力菌株，其變異位點(diǎn)在b亞基的編碼基因段，而c、a亞基基因比較保守。A基因型uncEBF表達(dá)高于B基因型，高耐酸力菌株uncEBF表達(dá)高于低耐酸力菌株，提示變鏈菌

6、不同基因型uncEBF基因的表達(dá)水平不同，表達(dá)水平高低及基因特殊位點(diǎn)突變可能與菌株的耐酸力相關(guān)。 3.F-ATPase的γ亞基結(jié)構(gòu)基因uncG通過AluI-RFLP和BsrI-RFLP分析也出現(xiàn)四種基因型A、B、C、D，不同基因型uncG菌株的分布差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同基因型序列所翻譯的氨基酸其同源性達(dá)100％，提示變鏈菌uncG基因遺傳多態(tài)性與菌株的耐酸力不相關(guān)，導(dǎo)致基因分型的基因點(diǎn)突變是沉默的(silent)。來自不同耐酸

7、力菌株和不同基因型uncG的在mRNA水平的表達(dá)差異也沒有顯著性，提示基因的相對恒定表達(dá)和保守為該亞基作為恒定旋轉(zhuǎn)中心以實(shí)現(xiàn)F-ATPase的催化作用提供了保證。 4.F-ATPase的α亞基結(jié)構(gòu)基因uncA的HphⅠ-RFLP和MboⅡ-RFLP分析表現(xiàn)4種基因型：A、B型uncA在不同齲敏感組變鏈菌株的分布不同，A基因型在高齲組的檢出高于無齲組，C、D型uncA在不同耐酸力菌株的分布不同，高耐酸性菌株中C型基因uncA的檢出

8、高于低耐酸力菌株；C、D型uncA的mRNA3表達(dá)水平不同，且在不同的耐酸株表達(dá)也不同，C型基因表達(dá)高。提示uncA基因多態(tài)性與菌株的耐酸力和致齲性相關(guān)，其基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)可能影響F-ATPase的酸調(diào)節(jié)能力。 5.F-ATPase的β亞基結(jié)構(gòu)基因uncD具有A、B兩種AluI-RFLP基因型，它們在不同耐酸力菌株的分布不同，A型高耐酸株的比例較低耐酸株高，但其mRNA表達(dá)水平與B基因型沒有顯著性差異。引起基因分型的堿基變異區(qū)域編碼

9、的氨基酸殘基不在β亞基的催化位點(diǎn)區(qū)域，提示突變不引起催化功能氨基酸的改變，可能參與結(jié)合氨基酸的調(diào)控；不同的耐酸株uncD的mRNA表達(dá)水平明顯不同，高耐酸的菌株有β亞基基因的上調(diào)。 綜上所述，變鏈菌產(chǎn)酸因子LDH和耐酸因子F-ATPase各亞基基因在基因表型和mRNA表達(dá)水平上均具有明顯的遺傳多態(tài)性，且基因的遺傳多態(tài)性與菌株的產(chǎn)酸和耐酸能力密切相關(guān)，變鏈菌可能通過LDH和F-ATPase基因的變異及轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)上調(diào)產(chǎn)酸和耐酸力