差異致齲性變形鏈球菌臨床分離株細(xì)胞外比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、變形鏈球菌是口腔內(nèi)的重要致齲菌之一，也被證明與許多全身系統(tǒng)性疾病有密切的關(guān)系。細(xì)胞外蛋白往往含有致病或毒性因子，與疾病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，對病理研究和抗生素開發(fā)等具有重要意義。
　　蛋白質(zhì)組即是在特定時間細(xì)胞內(nèi)的所有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平研究動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、修飾狀態(tài)和表達(dá)水平，從而了解蛋白質(zhì)之間的相互作用。細(xì)菌的細(xì)胞外蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)是一個相當(dāng)成熟的研究領(lǐng)域，并取得了重要的研究成果。
　　我們分三部分內(nèi)容對差異致齲

2、性變形鏈球菌臨床分離株細(xì)胞外蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究，希望從蛋白質(zhì)水平探討變形鏈球菌的致齲機(jī)理，為臨床齲病防治提供幫助。
　　第一部分 致齲模型建立-羥基磷灰石粘附實(shí)驗(yàn)，大鼠致齲模型
　　實(shí)驗(yàn)一 唾液包被的羥基磷灰石致齲模型建立
　　變鏈菌粘附牙面，并最終形成牙菌斑生物膜，之后其耐酸產(chǎn)酸能力，致使其具有強(qiáng)的致齲性。而粘附能力，是變鏈菌致齲的基礎(chǔ)。我們首先通過唾液包被的羥基磷灰石粘附實(shí)驗(yàn)，對課題組前期分離鑒定的5株變形鏈球菌臨

3、床分離株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)各臨床菌株之間的粘附能力差異顯著，其中5號菌株粘附能力最強(qiáng)，4號菌株最弱。研究結(jié)果驗(yàn)證了變形鏈球菌臨床分離株致齲特性的差異性，同時也建立了檢測變形鏈球菌致齲特性的體外實(shí)驗(yàn)方法，為后續(xù)蛋白質(zhì)致齲機(jī)制研究提供了手段;
　　實(shí)驗(yàn)二 Wistar大鼠致齲模型建立
　　我們建立了大鼠致齲模型，使用5號高致齲菌株作為實(shí)驗(yàn)組用菌涂布于大鼠口腔內(nèi)，對照組涂布生理鹽水。經(jīng)過兩個月的實(shí)驗(yàn)周期，結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組大鼠磨牙成功形

4、成可觀察的齲壞，而對照組則只呈現(xiàn)陰性結(jié)果。動物實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證科學(xué)結(jié)論的金標(biāo)準(zhǔn)，我們在本實(shí)驗(yàn)平臺，建立了標(biāo)準(zhǔn)的，可重復(fù)的大鼠致齲模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)夯實(shí)了基礎(chǔ);
　　第二部分 差異致齲性變鏈菌細(xì)胞外比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　我們在本實(shí)驗(yàn)室條件下，測定了變形鏈球菌生長曲線。實(shí)驗(yàn)提取了變形鏈球菌對數(shù)生長末期的培養(yǎng)上清，通過TCA沉淀法得到變鏈菌的全細(xì)胞外蛋白。對其進(jìn)行了雙向電泳，及后期的質(zhì)譜分析。通過雙向電泳我們比較了18個存在表達(dá)差異的點(diǎn)

5、白點(diǎn)。質(zhì)譜分析后，我們最后鎖定了S1(30S ribosomal protein S1)，SacB(levansucrase precursor)兩個差異蛋白。他們在高低致齲性變形鏈菌細(xì)胞外蛋白雙向電泳中顯著差異表達(dá)，可能是導(dǎo)致上述臨床菌株致齲差異的關(guān)鍵因素。
　　第三部分 變形鏈球菌菌S1，SacB蛋白的表達(dá)純化
　　我們首先在基因水平對S1，sacB基因進(jìn)行了檢測。qRT-PCR結(jié)果顯示S1，SacB在高致齲菌轉(zhuǎn)錄過程中