變異鏈球菌生物膜致齲差異初步研究.pdf

1、齲病是危害人類口腔健康的常見病，變異鏈球菌(簡稱變鏈菌)是公認的主要致齲菌，對其研究目前已深入到分子水平。但是，長期以來的絕大多數(shù)研究是以懸浮于培養(yǎng)基中的浮游狀態(tài)細胞作為研究對象，而在自然條件下，變鏈菌在口腔中是以牙菌斑這一典型的生物膜結構形式存在。牙齒萌出到口腔后，變鏈菌即在牙面黏附和聚集，最終形成復雜的生物膜結構以適應不斷變化的口腔環(huán)境，并在條件合適時致齲。因此，研究變鏈菌生物膜的致齲特性對于進一步闡明齲病發(fā)病機制、疾病風險性評估以

2、及生態(tài)防治均有重要意義。同時，隨著科學技術的發(fā)展和激光共聚焦掃描顯微鏡的問世，近來實時、完整、動態(tài)地觀察生物膜已成為可能。
　　 另一方面，隨著對變鏈菌致齲生物學性能的廣泛、深入研究，學者們發(fā)現(xiàn)在致齲過程中變鏈菌的數(shù)量并不是唯一的決定因素，其菌株間存在的致齲能力差異也是重要的影響因素，因此，了解變鏈菌臨床株間致齲能力的差異將有助于提高齲病風險性預測的準確性。為研究變鏈菌菌株間致齲性的差異及其原因，本課題組前期已分別自高齲患者和無

3、齲健康人口內(nèi)分離獲得血清C型變鏈菌593號臨床株和18號臨床株，兩菌株不僅在體內(nèi)表現(xiàn)出致齲差異，通過基因型分析、系列體外致齲實驗和蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)，其基因型、體外致齲能力和功能蛋白表達均存在差異。在此基礎上，本研究利用激光共聚焦掃描顯微鏡和熒光染色技術，以及掃描電鏡對變鏈菌標準株ATCC25175、593號臨床株和18號臨床株的生物膜分別進行定性、定位和定量的比較研究。本研究包括四部分實驗：
　　 實驗一變異鏈球菌生物膜形成能力

4、差異研究
　　 目的：了解變鏈菌標準株ATCC25175、593號臨床株和18號臨床株各自體外生物膜的連續(xù)動態(tài)形成演替過程及其差異。
　　 方法：在聚苯乙烯塑料片上分別形成0.5，1，1.5，2，4，6，12，16，18，20，72小時變鏈菌生物膜標本，應用激光共聚焦掃描顯微鏡及死菌和活菌熒光染色技術相結合的方法，對各時間段的菌斑生物膜進行原位、實時觀察，通過對斷層掃描圖像的重建得到生物膜的三維圖像，測量生物膜厚度，計算

5、生物膜中細菌密度和活菌百分比。
　　 結果：各菌株在聚苯乙烯塑料片表面均可黏附形成具有空間立體結構，形態(tài)多樣的致密生物膜，其主要由非均質(zhì)分布的死細菌和活細菌組成，且同菌株不同層面以及不同時間段生物膜的細菌密度和死菌活菌比均不同。不同菌株同時間段形成的生物膜厚度、細菌密度、活菌百分比也存在差異。
　　 結論：變鏈菌生物膜是由大量微菌落組成，具一定厚度、形態(tài)結構復雜多樣、不均質(zhì)的三維結構。593號臨床株的生物膜形成能力強于1

6、8號臨床株和標準株ATCC25175，18號臨床株和標準株ATCC25175間差異無顯著意義。
　　 實驗二變異鏈球菌生物膜狀態(tài)黏附能力差異研究
　　 目的：了解變鏈菌標準株ATCC25175、593號臨床株和18號臨床株在體外黏附、聚集形成生物膜的過程及其表面形態(tài)和差異。
　　 方法：在聚苯乙烯塑料片上分別形成2，3，4，6，12，20小時變鏈菌生物膜標本，用掃描電鏡觀察各時間段生物膜標本的表面形態(tài)和變鏈菌黏附

7、情況。
　　 結果：各時間段變鏈菌不同菌株對聚苯乙烯塑料片的黏附能力不同，其形成的生物膜表面形態(tài)也存在差異。
　　 結論：593號臨床株的黏附能力強于18號臨床株和標準株ATCC25175，18號臨床株和標準株ATCC25175間未見明顯差異。
　　 實驗三變異鏈球菌生物膜耐酸能力差異研究
　　 目的：了解變鏈菌標準株ATCC25175、593號臨床株和18號臨床株生物膜的耐酸能力及其差異。
　　

8、 方法：(1)首先在聚苯乙烯塑料片上分別形成幼齡生物膜(3小時)、成熟生物膜(20小時)標本，然后將不同時間段形成的生物膜標本隨機分成預酸化組和非預酸化組。預酸化組先將生物膜標本置于pH5.5的TPY液體培養(yǎng)基中預酸化3小時，然后再將之置于pH3.0的TPY液體培養(yǎng)基中強酸化30min；非預酸化組則直接將生物膜標本置于pH3.0的TPY液體培養(yǎng)基中強酸化30min。酸化后的標本采用熒光染色技術分別對死菌和活菌進行染色，然后通過激光共聚焦

9、掃描顯微鏡觀察；(2)在聚苯乙烯塑料片上形成20小時變鏈菌生物膜標本，然后將之隨機分成饑餓組和非饑餓組。饑餓組置于PBS液緩沖液中(無營養(yǎng)培養(yǎng))，非饑餓組置于TPY液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24小時后取出生物膜標本，再置于pH3.0的TPY液體培養(yǎng)基中強酸化30min，然后同上法觀察生物膜標本。
　　 結果：(1)經(jīng)過預酸化處理的幼齡生物膜(3小時)、成熟生物膜(20小時)標本經(jīng)強酸化后的活菌比例均較非預酸化組增高，其中593號臨床

10、株生物膜的活菌比例顯著高于其他菌株。(2)無論是否經(jīng)過預酸化處理，幼齡生物膜(3小時)標本酸化后活菌數(shù)量下降較成熟生物膜(20小時)標本酸化后活菌數(shù)量下降更為顯著，其中593號臨床株生物膜活菌數(shù)量下降較其他菌株為少。(3)饑餓生物膜酸化后活菌比例顯著高于非饑餓生物膜，其中593號臨床株的活菌比例顯著高于其他菌株。
　　 結論：變鏈菌生物膜經(jīng)過預酸化可具有更強的耐酸能力；幼齡生物膜(3小時)的耐酸能力較成熟生物膜(20小時)弱；饑

11、餓可增加變鏈菌生物膜的耐酸能力；各狀態(tài)下593號臨床株生物膜的耐酸能力均強于18號臨床株和標準株ATCC25175，18號臨床株和標準株ATCC25175間差異無顯著意義。
　　 實驗四變異鏈球菌生物膜合成胞外多糖能力差異研究
　　 目的：了解變鏈菌標準株ATCC25175、593號臨床株和18號臨床株生物膜不同時間段合成胞外多糖的變化情況及其差異。
　　 方法：(1)在聚苯乙烯塑料片上分別形成3，12，20小時

12、變鏈菌生物膜標本，用熒光染料FITC-ConA對胞外多糖進行染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。(2)將變鏈菌分別進行靜置培養(yǎng)，以得到生物膜狀態(tài)生長的變鏈菌，葸酮法測量生物膜狀態(tài)下不同時間段變鏈菌合成胞外多糖能力的差異。
　　 結果：同菌株不同時間段生物膜胞外多糖的分泌量和分布不同，同時不同菌株間也存在差異。
　　 結論：生物膜形成過程的不同階段其合成胞外多糖的能力不同；相同條件下，593號臨床株生物膜合成胞外多糖的能力強于