C-di-GMP信號通路和RgpAc基因調(diào)節(jié)變形鏈球菌致齲特性的初步研究.pdf

1、齲病是人類最常見的細(xì)菌感染性疾病之一，發(fā)病率高，涉及范圍廣。變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)作為齲病主要的致病菌，擁有復(fù)雜的毒力因子，參與了其在牙面的黏附、聚集、菌斑生物膜的形成、產(chǎn)酸耐酸等作用。比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)一類含有GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白在各類細(xì)菌中普遍存在，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其功能主要是參與3'-5'環(huán)二鳥苷酸(bis-(3'-5')-cyclicdimeric guanosine

2、monophosphate，c-di-GMP)的合成與分解，該結(jié)構(gòu)域能夠催化兩個GTPs合成c-di-GMP。大部分的GGDEF結(jié)構(gòu)域在臨近N端的活性位點處含有一個Ⅰ位點，該位點可以與非競爭性抑制產(chǎn)物c-di-GMP結(jié)合，這種別構(gòu)抑制作用能夠限制c-di-GMP的濃度，阻止GTP的過度消耗。磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)上的EAL結(jié)構(gòu)域具有水解c-di-GMP的作用，其水解產(chǎn)物是線性的5'-磷酸鳥苷酸-（3

3、'-5'）-鳥苷(5'-phosphoguanylyl-(3'-5')-guanosine，5'-pGpG)分子，這些小分子物質(zhì)不具備生物活性，在細(xì)胞內(nèi)很快被其它的磷酸二酯酶降解。通常情況下，GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域存在于同一個蛋白的C端，而負(fù)責(zé)信號感知及傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域則位于蛋白的N端，可以感知一系列信號，例如PAS和GAF結(jié)構(gòu)域，涉及到細(xì)胞內(nèi)小分子的結(jié)合或者蛋白與蛋白之間的相互作用。除此之外，還有一小部分GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白的N

4、端整合在細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)感知信號，但是目前還不清楚這些結(jié)構(gòu)域能夠感知什么樣的信號。近年來的研究已經(jīng)證實，c-di-GMP是原核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一類新的第二信使，是一種小分子復(fù)合物，具有熱穩(wěn)定性，能夠激活纖維素合成酶，參與多種復(fù)雜的生理活動的調(diào)控。它的作用涉及細(xì)菌細(xì)胞的分化、生物膜的形成、細(xì)胞間的通訊、毒力因子的表達(dá)以及與宿主細(xì)胞間相互作用等多個方面，是細(xì)菌生存和代謝過程中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一。研究發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌中存在c-di-GMP信號通路

5、，外源性c-di-GMP的加入和內(nèi)源性c-di-GMP的喪失均會降低變形鏈球菌的致齲特性（表現(xiàn)為生物膜形成量減少)，但其機(jī)制尚不清楚。對這些問題進(jìn)一步的研究將有助于加深對變形鏈球菌中c-di-GMP信號途徑的作用方式的認(rèn)識，也為探索新的防齲方法提供了依據(jù)。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了變形鏈球菌內(nèi)gcp基因敲除菌株，以便更全面、深入的探討變形鏈球菌內(nèi)c-di-GMP的作用機(jī)制和信號通路，同時與S.mutans UA159野生菌株進(jìn)行

6、基因芯片比較，篩選和生物膜有關(guān)的基因進(jìn)行信號通路分析。本研究分為三個部分：
　　 第一章：變形鏈球菌gcp基因突變株的構(gòu)建。本實驗根據(jù)NCBI提供的S.mutans UA159全基因組序列，采用PrimerPremier5.0軟件(Premier公司)設(shè)計gcp基因的上游引物和下游引物，擴(kuò)增gcp基因的上游片段和下游片段。采用雙酶切及同源重組的方式構(gòu)建了含有壯觀霉素抗性(spe)的載體pFW5-gcp-UP-DOWN。在下一步實

7、驗中，采用同源重組的方式構(gòu)建變形鏈球菌gcp基因突變菌株。用限制性內(nèi)切酶NheⅠ酶(NEB公司)對載體pFW5-gcp-UP-DOWN進(jìn)行酶切，將環(huán)狀的質(zhì)粒變?yōu)榫€性化的片段，膠回收酶切后的線性化片段10 ug備用。取1 ml變形鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞菌液，加入30μl線性化的重組載體pFW5-gcp-UP-DOWN，采用同源重組的方式構(gòu)建變形鏈球菌gcp基因突變菌株，命名為gcp-KO。通過對轉(zhuǎn)化菌的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化菌形態(tài)與S.mutan

8、s UA159菌基本一致，但是細(xì)菌排列更為稀疏，這可能是由于基因缺陷后引起的生長差異所致。對重組載體進(jìn)行雙酶切鑒定結(jié)果顯示:重組載體pFW5-gcp-UP經(jīng)過SalⅠ和BglⅡ雙酶切后出現(xiàn)2條帶，與質(zhì)粒pFW5-gcp-UP的大小基本相同。重組載體pFW5-gcp-UP-DOWN經(jīng)過NcoⅠ和NdeⅠ雙酶切后出現(xiàn)2條帶，與質(zhì)粒pFW5-gcp-UP及gcp-DOWN的大小基本相同。對野生菌與轉(zhuǎn)化菌的gcp基因上下游片段、spe基因進(jìn)行P

9、CR擴(kuò)增及電泳鑒定結(jié)果顯示:野生菌株不能擴(kuò)增spe基因，而轉(zhuǎn)化菌株能夠擴(kuò)增上、下游基因及spe基因，表明spe基因成功轉(zhuǎn)入菌株基因組，測序結(jié)果也顯示gcp基因被spe基因所同源替代。
　　 第二章：變形鏈球菌gcp基因突變菌株表達(dá)譜基因芯片研究及驗證。提取變形鏈球菌gcp-KO及野生菌株的總RNA，參照大連寶生物工程公司1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書分別合成cDNA。對照組（野生菌株）加入

10、Cy5-CTP*(10mmol/L)，實驗組（突變菌株）加入Cy3-CTP*(10 mmol/L)進(jìn)行標(biāo)記，并采用3S柱PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，得到雜交混合液。吸取適量雜交混合液，使樣品液均勻的覆蓋在玻片的表面，檢查氣泡后將基因芯片字符面朝上放入芯片夾中，將芯片夾置入基因芯片掃描儀NimbleGen MS200中，采用MS200 Data Collection軟件，由儀器自動平衡紅綠熒光的激發(fā)光能量及增益值進(jìn)行掃描，獲得雙色疊加的雜交

11、結(jié)果圖，保存該結(jié)果。本實驗為了確定差異基因表達(dá)譜，采用國內(nèi)外基因芯片實驗常用標(biāo)準(zhǔn)Ratio'=2做為差異基因的初步篩選標(biāo)準(zhǔn)。上調(diào)基因篩選的轉(zhuǎn)錄差異要在2倍以上，即FC≥2。同樣下調(diào)基因篩選的轉(zhuǎn)錄差異也是2倍以上，即FC≤0.5。轉(zhuǎn)錄差異在0.5≤FC≤2之間的基因，被認(rèn)為沒有差別，不篩選進(jìn)入下一步研究，最終有411個基因符合條件。分別比較兩組數(shù)據(jù)中Cy5熒光信號強(qiáng)度和Cy3熒光信號強(qiáng)度，對于同一個探針，如果Cy5信號強(qiáng)度是Cy3的2倍或

12、2倍以上，認(rèn)為該探針?biāo)淼幕虮磉_(dá)降低;如果Cy3的信號強(qiáng)度是Cy5的2倍或2倍以上，說明該探針代表的基因表達(dá)升高。初步篩選411個差異基因，表達(dá)上調(diào)的基因198個，表達(dá)下調(diào)的基因213個。再結(jié)合GO分析、COG分析及KEGG分析的結(jié)果，最終確定8個基因進(jìn)入本課題的Real-time PCR驗證研究，其中上調(diào)基因和下調(diào)基因各4個。表達(dá)差異的基因按照功能進(jìn)行歸類，查閱GenBank數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)對其結(jié)果進(jìn)行深入的分析及討論。結(jié)合前期實

13、驗的結(jié)果，選擇RgpAc基因作為后續(xù)研究的目的基因。
　　 第三章：RgpAc基因突變株的構(gòu)建及功能研究：⑴RgpAc基因突變株的構(gòu)建。本實驗根據(jù)NCBI提供的S.mutans UA159全基因組序列，采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計RgpAc基因的上游引物和下游引物，擴(kuò)增RgpAc基因的上游片段和下游片段。采用雙酶切及同源重組的方式構(gòu)建了含有壯觀霉素抗性(spe)的載體pFW5-RgpAc-UP-DOWN。將載體加

14、入變形鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞中，采用同源重組的方式構(gòu)建變形鏈球菌RgpAc基因突變菌株，命名為RgpAc-KO。通過對轉(zhuǎn)化菌的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化菌形態(tài)與S.mutans UA159菌基本一致，但是細(xì)菌排列更為稀疏，這可能是由于基因缺陷后引起的生長差異所致。實驗還對野生菌與轉(zhuǎn)化菌的RgpAc基因及其上下游、spe基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與電泳鑒定。結(jié)果顯示，野生菌株含有RgpAc基因，不含有spe基因。而轉(zhuǎn)化菌株能夠擴(kuò)增載體的上、下游基因及spe

15、基因，不能擴(kuò)增RgpAc基因，表明轉(zhuǎn)化菌株有RgpAc基因缺陷。測序結(jié)果也顯示RgpAc基因被spe基因所同源替代。⑵變形鏈球菌RgpAc基因功能的研究。采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，對比了野生菌株和突變菌株在24 h、48 h形成的水溶性葡聚糖、水不溶性葡聚糖和胞外多糖的含量，以及野生菌株和突變菌株加入不同濃度的c-di-GMP之后，形成的生物膜含量。采用析因設(shè)計的方差分析的方法，各組計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式

16、列出，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。通過改良蒽酮比色法比較突變菌株和野生菌株胞外多糖的合成能力。實驗分為兩組，分別為野生菌株和突變菌株，24 h的樣本量為8例，48 h的樣本量為5例。野生菌株水溶性葡聚糖和胞外多糖生成量高于突變菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=328.868，P＜0.001; F=80.897，P＜0.001)，突變菌株水不溶性葡聚糖生成量高于野生菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.718，P＜0.001)。同一菌株不同的時間段相比，

17、野生菌株24 h和48 h產(chǎn)生的水溶性葡聚糖、水不溶性葡聚糖和胞外多糖差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=-36.022，P＜0.001;F=15.274，P＜0.001; F=-18.241，P＜0.001)，24 h處產(chǎn)生的水溶性葡聚糖高于48 h處，水不溶性葡聚糖低于48 h處，胞外多糖高于48 h處。突變菌株24 h和48 h產(chǎn)生的水溶性葡聚糖、水不溶性葡聚糖和胞外多糖差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=-7.537, P＜0.001; F=18.76

18、2,P＜0.001;F=-8.587,P＜0.001),24 h產(chǎn)生的水溶性葡聚糖高于48 h處，水不溶性葡聚糖低于48 h處，胞外多糖低于48 h處。在比較生物膜形成量的實驗中，S.mutans UA159與RgpAc-KO加入200μM和400μM的c-di-GMP后，設(shè)計了6組，每組有5例，采用析因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組菌株之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.411，P＜0.001)，突變菌株高于野生菌株;三個c-di-GMP濃度間的差

19、異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.945，P=0.033)，400μM組最高，空白對照組最低;在不加c-di-GMP干擾的時候，野生菌株和突變菌株之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.196，P＜0.001)，野生菌株更高;在加入200μM、400μM的c-di-GMP干擾后，野生菌株和突變菌株之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.467，P=0.002; t=-8.038，P＜0.001)，突變菌株均高于野生菌株;野生菌株加入不同濃度的c-di-GMP干

20、擾后，產(chǎn)生的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.766，P＜0.001)，不加c-di-GMP組最高，加入400μM的c-di-GMP組最低;突變菌株加入不同濃度c-di-GMP干擾后，產(chǎn)生的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=48.322，P＜0.001)，不加c-di-GMP組最低，加400μM的c-di-GMP組最高;交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.529，P＜0.001)。實驗結(jié)果表明變形鏈球菌RgpAc基因敲除后，細(xì)菌形成生物膜的能力被抑制。在變形

21、鏈球菌中，各種水溶性和水不溶性的多糖是生物膜形成的重要基質(zhì)之一。當(dāng)變形鏈球菌的RgpAc基因敲除后，合成水溶性葡聚糖和胞外多糖的能力均下降，導(dǎo)致生物膜形成的基質(zhì)缺乏，最終抑制了生物膜的形成。突變菌株加入不同濃度的c-di-GMP之后，生物膜形成能力增加，推測原因是外源性的c-di-GMP增加后促進(jìn)了其與下游信號通路受體的結(jié)合，最終使生物膜的形成量增加。為了比較兩種細(xì)菌在牙齒表面形成的生物膜結(jié)構(gòu)的差異，實驗?zāi)M體內(nèi)情況在釉質(zhì)表面形成人工生

22、物膜，并進(jìn)行了掃描電鏡觀察。結(jié)果顯示，RgpAc-KO與野生菌株培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)生的生物膜形態(tài)不相同。低倍鏡下可見S.mutansUA159組產(chǎn)生的生物膜較厚，排列較致密，RgpAc-KO組的生物膜結(jié)構(gòu)較松散，突變菌株分別加入200μM和400μM的c-di-GMP之后，細(xì)胞外基質(zhì)增加。高倍視野下可見S.mutans UA159組細(xì)菌之間有較多的細(xì)胞外基質(zhì)，生物膜上的細(xì)菌排列規(guī)律，形成漩渦狀結(jié)構(gòu);RgpAc-KO組細(xì)菌之間的細(xì)胞外基質(zhì)

23、較少，視野內(nèi)可見少量的細(xì)菌。突變菌株分別加入200μM和400μM的c-di-GMP之后，細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)變致密，細(xì)胞數(shù)目增多。提示RgpAc基因突變后降低了水溶性葡聚糖的合成，而水溶性葡聚糖既可作為細(xì)菌胞外能源物質(zhì)及代謝底物，又可與細(xì)菌表面的Gbp結(jié)合，能夠促進(jìn)黏附和聚集。因此在電鏡下觀察突變菌株的生物膜結(jié)構(gòu)較松散，細(xì)胞外基質(zhì)較少，視野內(nèi)細(xì)菌數(shù)量少。加入外源性c-di-GMP后增加了下游信號通路的活性，最終使生物膜的形成增加。綜上，本

24、實驗通過同源重組的方法構(gòu)建了變形鏈球菌gcp基因突變菌株，與野生菌株進(jìn)行了基因芯片比較，表達(dá)差異在2倍以上的基因有411個，包括198個表達(dá)上調(diào)的基因和213個表達(dá)下調(diào)的基因。通過查閱資料，最終挑選8個最有可能與變形鏈球菌生物膜形成及信號通路有關(guān)的基因進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)RgpAc基因表達(dá)抑制的程度最大，因此課題組選擇該基因作為下一步研究的目的基因，構(gòu)建了變形鏈球菌RgpAc基因突變菌株。利用比色、電鏡掃描等實驗方法初步研究了該基因缺失對變形