水稻白葉枯病毒C-di-GMP信號(hào)代謝酶相關(guān)基因PXO-03877和PXO-01021的功能分析.pdf

1、水稻白葉枯病是由黃單胞水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡(jiǎn)稱Xoo)引起的重要的細(xì)菌性病害。Xoo-水稻互作是研究病原細(xì)菌-寄主植物互作的重要模式系統(tǒng)之一。環(huán)二鳥苷磷酸(c-di-GMP)是一種廣泛存在于細(xì)菌中的第二信使，調(diào)控著細(xì)菌毒性、生物膜形成和運(yùn)動(dòng)性等諸多生物學(xué)功能。鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)分別控制了c-di-GMP的合成和降解。近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室一直致力于解析c-di-GM

2、P信號(hào)途徑及其對(duì)Xoo毒性的調(diào)控機(jī)制，為全面地揭示細(xì)菌致病分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。前期已從Xoo中鑒定了PXO_03877和PXO01021基因，發(fā)現(xiàn)它們分別編碼EAL單一結(jié)構(gòu)域、含有PAS/GGDEF/EAL雜合結(jié)構(gòu)域的蛋白，推測(cè)它們分別具有PDE和DGC活性。本論文首先對(duì)Xoo中與c-di-GMP信號(hào)代謝相關(guān)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并重點(diǎn)從解析蛋白活性位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域功能的角度出發(fā)，對(duì)PXO03877和PXO01021基因的生物學(xué)功能進(jìn)

3、行了深入分析，取得以下主要研究結(jié)果:
　　1.Xoo基因組中DGC和PDE編碼基因的預(yù)測(cè)和分析在全基因組水平分析了Xoo菌株P(guān)XO99A、MAFF311018和KACC10331中與c-di-GMP信號(hào)代謝相關(guān)的基因。通過(guò)分析這些蛋白的輸出結(jié)構(gòu)域(GGDEF、EAL和HD-GYP)的序列特征，發(fā)現(xiàn)了一些蛋白可能具有DGC或PDE活性，另外一些可能是c-di-GMP受體或結(jié)合蛋白。鑒定了這些基因編碼的蛋白中存在的多種不同的信號(hào)輸入結(jié)

4、構(gòu)域(REC、PAS、GAF、HAMP等)，感知環(huán)境信號(hào)變化，調(diào)控下游輸出結(jié)構(gòu)域的活性和功能。c-di-GMP代謝相關(guān)基因分散于整個(gè)基因組中，但也有集聚現(xiàn)象。絕大部分基因在3個(gè)菌株中存在相同的序列，但也發(fā)現(xiàn)了個(gè)別菌株特異的基因。
　　2.PXO_03877基因互補(bǔ)和位點(diǎn)突變菌株的功能鑒定構(gòu)建了基因缺失突變體ΔPXO03877的互補(bǔ)株，構(gòu)建了點(diǎn)突變(ΔPXO_03877∷E153A和ΔPXO03877∷E176A)菌株，測(cè)定了它們與

5、毒性相關(guān)的表型。發(fā)現(xiàn)ΔPXO_3877和ΔPXO03877∷E153A的致病性、生物膜形成能力以及EPS產(chǎn)生顯著性降低，PXO03877∷E153A對(duì)EPS產(chǎn)生量比ΔPXO3877更低，ΔPXO_03877∷E176A對(duì)這些生物學(xué)特性的影響不顯著。所有菌株對(duì)運(yùn)動(dòng)性的影響不顯著。說(shuō)明PXO03877E153是活性關(guān)鍵位點(diǎn)，而PXO03877E176位點(diǎn)的突變對(duì)整個(gè)基因的活性無(wú)明顯影響。
　　3.PX001021基因互補(bǔ)和過(guò)表達(dá)的功能

6、分析構(gòu)建了基因缺失突變體ΔPXO01021的全長(zhǎng)互補(bǔ)、全長(zhǎng)過(guò)表達(dá)、GGDEF結(jié)構(gòu)域過(guò)表達(dá)以及EAL結(jié)構(gòu)域過(guò)表達(dá)菌株，測(cè)定了它們與毒性相關(guān)的表型。發(fā)現(xiàn)ΔPXO_01021缺失突變體對(duì)水稻的致病性有增強(qiáng)趨勢(shì)，而全長(zhǎng)過(guò)表達(dá)菌株致病性顯著降低，單獨(dú)GGDEF或EAL結(jié)構(gòu)域的過(guò)表達(dá)菌株致病性無(wú)顯著變化;所有菌株生物膜形成能力、EPS產(chǎn)生和運(yùn)動(dòng)性無(wú)明顯變化。說(shuō)明GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域之間可能有互相的影響，因此只有全長(zhǎng)才具有完全的活性，而單個(gè)結(jié)構(gòu)域