重組人B7-H1IgV腫瘤疫苗的發(fā)酵純化工藝研究和抑瘤活性的檢測.pdf

1、目的：B7-H1是共刺激分子B7-H1家族成員，B7-H1主要通過其IgV樣區(qū)與受體PD-1結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用，參與腫瘤的免疫逃逸。近年來的研究表明，阻斷B7-H1，可以顯著的抑制腫瘤的生長。本實驗室先前構(gòu)建了重組人B7-H1IgV蛋白，檢測免疫該蛋白小鼠的抗血清活性及蛋白疫苗對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用，表明重組人B7-H1IgV蛋白疫苗既可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的抗B7-H1抗體和腫瘤特異性的細胞免疫，又能協(xié)同其它腫瘤疫苗發(fā)揮的抗腫

2、瘤作用。為了進一步加快該制品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，本課題擬通過全面檢定工程菌，建立穩(wěn)定的重組人B7-H1IgV工程菌菌種庫，并建立穩(wěn)定的發(fā)酵純化生產(chǎn)工藝。
　　方法：首先，通過對重組人B7-H1IgV工程菌進行重組質(zhì)粒酶切鑒定和序列分析、IPTG誘導(dǎo)后表達水平的檢測、連續(xù)傳代50代的工程菌每隔10代進行攜帶質(zhì)粒及其表達目的蛋白穩(wěn)定性的檢測，形態(tài)學(xué)的電鏡觀察，革蘭氏染色檢定和生化反應(yīng)的檢定，建立穩(wěn)定可靠的工程菌菌庫；然后依次通過5L發(fā)酵罐連

3、續(xù)三批工程菌的發(fā)酵，裂菌，包涵體溶解，建立穩(wěn)定的發(fā)酵工藝，再通過目的蛋白的復(fù)性，兩次Ni親和層析純化，建立穩(wěn)定可靠的純化工藝；最后通過動物實驗對生產(chǎn)的目的蛋白的免疫原性，抑瘤活性進行檢測。
　　結(jié)果：工程菌重組質(zhì)粒的酶切和測序結(jié)果與預(yù)期一致，目的蛋白表達量達到10％以上，工程菌連續(xù)傳50代，每隔10代的工程菌質(zhì)粒酶切結(jié)果和目的蛋白表達水平均一致，電鏡結(jié)果顯示工程菌呈明顯的大腸桿菌形態(tài)，且無其它微生物的污染，革蘭氏染色結(jié)果顯示工程菌

4、呈革蘭氏陰性，各項生化反應(yīng)檢定結(jié)果表明工程菌為大腸桿菌。5L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵3批工程菌均可得到約190克濕菌，且各批菌表達目的蛋白水平均在10％以上。添加GSH/GSSG氧化還原系統(tǒng)參與蛋白復(fù)性，顯著提高了復(fù)性過程目的蛋白的可溶性，兩次Ni親和層析純化目的蛋白，純度達到95％以上。B7-H1IgV蛋白免疫小鼠，兩周內(nèi)抗B7-H1的抗血清可達到1×104以上，B7-H1IgV能夠顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，抑瘤率達到30％。
　　結(jié)論