農(nóng)桿菌介導(dǎo)ClCBF1基因轉(zhuǎn)化地被菊‘雪公主’的研究.pdf

1、地被菊(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)是菊花中具有植株低矮、抗逆性強(qiáng)、管理粗放和花緊密等特點(diǎn)的一個(gè)品種群。由于其盛花期在“十一”前后，這一新型菊花已在很多地區(qū)得到推廣和應(yīng)用。但是，這種新型菊花在我國(guó)北方應(yīng)用受到的一個(gè)限制性因素就是在秋冬季露地生長(zhǎng)情況下綠期較短。因此，開(kāi)展培育耐寒性較強(qiáng)的品種并加以應(yīng)用顯得尤為重要。大量的研究已表明CBF1轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)引起一些冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而達(dá)到提高植物總體的抗

2、寒能力。本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)地被菊‘雪公主’高效再生體系及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系的研究，將CICBF1轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到其中，以期望獲得抗性較強(qiáng)的新品種，并為廣泛運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良菊花品種打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　本研究以地被菊‘雪公主’為試驗(yàn)材料，研究了不同激素濃度配比和葉片發(fā)育程度對(duì)葉片再生能力的影響，以及對(duì)莖段分化和生根誘導(dǎo)的影響。由此對(duì)‘雪公主’的再生條件進(jìn)行了優(yōu)化，從而獲得了高效的再生體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，地被菊‘雪公主

3、’著生在植株頂端的幼嫩葉片比著生在植株基部的葉片分化率高;同一葉片基部的分化率高于中部;其最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-16-BA+0.6mg·L-1NAA;莖段增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.3mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA;繼代培養(yǎng)為MS培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg·L-1NAA培養(yǎng)基;再生苗移栽后生長(zhǎng)良好。
　　在高效再生體系建立的基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了

4、研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)的轉(zhuǎn)化體系為:在最佳誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)1d的葉盤(pán)置于OD600為0.5～0.6的菌液中侵染10min，共培養(yǎng)2d后將葉盤(pán)接到MS+0.6mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA+5mg·L-1Km+350mg·L-1Carb培養(yǎng)基上進(jìn)行延遲篩選，3d后接種到MS+0.6mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA+5mg·L-1Km+200mg·L-1Carb分化篩選培養(yǎng)基中，待分化出不定芽后，將

5、1.5cm左右的不定芽接到1/2MS+0.5mg·L-1NAA+4mg·L-1Km的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根篩選。利用此體系進(jìn)行了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化，有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。
　　本研究在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的卡那霉素生根篩選得到12株抗性植株的基礎(chǔ)上，分別提取獲得的抗性地被菊單株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，結(jié)果共獲得陽(yáng)性植株2株，轉(zhuǎn)化率為0.67％。之后提取陽(yáng)性植株的RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，得到了與陽(yáng)性對(duì)照CICBF1