基于蛋白組學(xué)的miR-101的調(diào)控環(huán)路與靶點研究.pdf

1、第一部分miR-101的雙向負反饋環(huán)路
　　目的:研究肝癌細胞中miR-101與EZH2之間的相互調(diào)控作用。方法:通過基因功能獲得與失活策略,研究miR-101與EZH2在mRNA及蛋白水平上的相互關(guān)系。利用miRNA前體誘導(dǎo)實驗,證實miR-101/EZH2調(diào)控環(huán)路的效用并確定miR-101/EZH2調(diào)控環(huán)路的參與者。利用定量基因組PCR,研究miR-101缺失與miR-101前體誘導(dǎo)效率之間的關(guān)系。利用集落形成實驗,遷移/侵襲

2、實驗、劃痕實驗評價升高miR-101后對肝癌細胞遷移及增殖能力的抑制作用。結(jié)果:升高miR-101可以降低EZH2的表達水平,而EZH2的表達升高可以抑制miR-101的表達。miR-101前體誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn),成熟miR-101只能誘導(dǎo)pre-mir-101-1的表達而對pre-mir-101-2的誘導(dǎo)作用不明顯。HepG2與SMMC-7721細胞中,miR-101前體誘導(dǎo)效率的不同,與細胞中miR-101位點缺失程度有關(guān)。升高miR-1

3、01可以明顯抑制肝癌細胞遷移及增殖能力。結(jié)論:在肝癌細胞中,miR-101與EZH2是以雙向負反饋環(huán)路的形式進行相互調(diào)控的。干預(yù)這一環(huán)路對肝癌有抑制作用。
　　第二部分利用雙向電泳檢測miRNA調(diào)控靶點的技術(shù)建構(gòu)
　　目的:構(gòu)建可用于miRNA靶點發(fā)現(xiàn)的雙向電泳體系。方法:利用慢病毒過表達載體,構(gòu)建穩(wěn)定表達miR-101的肝癌細胞系。通過雙向電泳技術(shù),分析過表達miR-101細胞系與空載體細胞系蛋白質(zhì)譜的變化,從而實現(xiàn)miR

4、-101調(diào)控靶點的鑒定。結(jié)果:利用24㎝pH3~10非線性固相pH梯度干膠條,在10％的PAGE膠上可以分離到600個左右的蛋白質(zhì)點,組內(nèi)重復(fù)性較好,蛋白點匹配率達到99%以上。組間差異較大的蛋白質(zhì)點20個左右。結(jié)論:利用雙向電泳技術(shù),可以同時發(fā)現(xiàn)諸多microRNA調(diào)控靶點。這為microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了一個新的思路。
　　第三部分miR-101調(diào)控靶點的質(zhì)譜鑒定與分析
　　目的:利用高效色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定mi