在膠質(zhì)瘤細胞系中利用蛋白組學技術(shù)探究miR-45新的直接作用靶點的實驗研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，且其發(fā)病率隨年齡增大有增高的趨勢，具有侵襲性生長，無控性增殖，易復發(fā)等特點。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、化療和放療，治療效果差，不能明顯的提高患者的生存率。特別是Ⅲ級（WHO分級）間變性膠質(zhì)瘤和Ⅳ級（WHO分級）膠質(zhì)母細胞瘤，因其高增殖及侵襲性生物學特性，雖經(jīng)手術(shù)為主的聯(lián)合放射及化學治療，預后并沒有得到明顯改善，其平均生存時間分別僅為1.5年和9-12個月。膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病

2、，通常伴有原癌基因的過表達和抑癌基因的突變?nèi)笔В虼?，在基因水平探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，從根本上糾正與膠質(zhì)瘤發(fā)生，發(fā)展相關(guān)的基因異常，探索基因治療方法已成為醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點。
　　 miRNA是一類長約19-24nt的非編碼RNA，能夠與靶基因的3'端非編碼區(qū)(3' UTR)結(jié)合而抑制靶mRNA的翻譯或使其降解，對基因表達起到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用。microRNA通過調(diào)控復雜的細胞信號通路網(wǎng)絡和對細胞的多方面生物學行為影響，直接

3、或者間接參與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展。microRNA和腫瘤之間的密切聯(lián)系已經(jīng)成為醫(yī)學科學研究領(lǐng)域的另一熱點。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)microRNA的異常表達與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。miR-21的高表達可以促進U251膠質(zhì)細胞瘤的侵襲性生長，miRNA-128直接結(jié)合于Bmi-1mRNA的3'非編碼區(qū)的一個結(jié)合位點，抑制Bmi-1致癌基因表達，抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖。
　　 MiR-451位于染色體17q11.2，與原癌基因人類

4、表皮生長因子受體2的17q11.2-21區(qū)域臨近。近年來有研究發(fā)現(xiàn)異常表達的miR-451與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展有密切的關(guān)系。Gal等研究表明miR-451在惡性膠質(zhì)瘤干細胞中低表達，miR-451聯(lián)合抗腫瘤藥甲磺酸伊馬替尼能明顯抑制膠質(zhì)瘤干細胞的生長和增殖。在胃癌和結(jié)腸直腸癌中miR-451低表達，并且通過直接靶標癌基因巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）發(fā)揮抑癌因

5、子的作用，miR-451高表達時能降低細胞的增值能力，增加細胞對放療的敏感性，而低表達時與患者較差的預后密切相關(guān)。miR-451還可以通過抑制c-myc的表達明顯抑制結(jié)腸癌細胞系SW620裸鼠皮下種植瘤的生長。另外，近年來亦有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451與腫瘤的耐藥性有密切的關(guān)系。miR-451可能通過誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，上調(diào)bax蛋白及下調(diào)p-Akt(Ser473)、bcl-2蛋白表達而逆轉(zhuǎn) A549/DDP細胞對DDP的耐藥性

6、，在乳腺癌多藥耐藥細胞系MCF-7/DOX中，過表達miR-451通過直接調(diào)控耐藥基因MDR1的表達，增強細胞對阿霉素的敏感性。也有研究報道稱卵巢癌多藥耐藥的癌細胞系A(chǔ)2780DX5和KB-V1中抑制miR-451或miR-27a的表達可導致MDR1的mRNA和蛋白水平的下降，從而增加細胞系對藥物（長春堿、阿霉素）的敏感程度。
　　 本課題組在預實驗研究中通過miRNA微陣列芯片雜交發(fā)現(xiàn):6個膠質(zhì)瘤細胞系中miR-451表達下調(diào)

7、為正常腦組織的50％以下，miR-451在膠質(zhì)瘤中作為抑癌因子可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞系(LN229，U87和U251)的增殖，轉(zhuǎn)移，侵襲，誘導細胞周期阻滯和促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。本課題組并對miR-451的作用機制進行了研究，通過生物學信息預測，western blot和熒光素酶等試驗發(fā)現(xiàn)CAB39為miR-451的直接作用靶點，miR-451有可能通過直接靶標CAB39調(diào)控PI3K/AKT信號通路進而發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。為進一步研

8、究miR-451的作用機制，尋找miR-451的直接作用靶點至關(guān)重要，以期為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的思路，本課題首先利用蛋白組學從整體上研究miR-451對膠質(zhì)瘤細胞系U87基因的表達的影響并結(jié)合生物學信息預測軟件miranda，預測出miR-451可能的直接作用靶點，然后再利用western blot和熒光素酶實驗對預測出的可能的直接靶點進行實驗驗證。
　　 本課題研究分為以下三部分:
　　 第一部分、將膠質(zhì)瘤細胞系U

9、87分成兩組:未作任何處理的為對照組，應用寡核苷酸miR-451 mimics轉(zhuǎn)染的為處理組，培養(yǎng)24小時之后提RNA利用Real-time PCR檢測miR-451的表達，利用iTRAQ試劑標記的蛋白組學技術(shù)整體上研究miR-451對膠質(zhì)瘤細胞系U87基因表達的影響并結(jié)合microRNA的靶點預測軟件miranda預測miR-451的可能的作用靶點。結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組基因表達差異≥1.5倍的有261種，其中143種基因表達

10、是降低的，118種基因表達是升高的，261種差異蛋白中結(jié)合miranda軟件預測出18種miR-451可能的直接作用靶點，包括10種表達降低的基因和8種表達升高的基因。
　　 第二部分、蛋白組學結(jié)合miranda軟件預測的miR-451的可能的靶點中包括YWHAE基因，有文獻報道YWHAE基因在乳腺癌，原發(fā)性肝癌和結(jié)腸癌中為促癌基因。本實驗利用膠質(zhì)瘤組織芯片的免疫組織化學技術(shù)和westem blot技術(shù)，探究YWHAE基因在膠質(zhì)

11、瘤組織和膠質(zhì)瘤細胞系中的表達。結(jié)果顯示，YWHAE基因的表達(14-3-3ε)在高級別膠質(zhì)瘤（WHO分級Ⅲ和Ⅳ級）中明顯高于低級別膠質(zhì)瘤（WHO分級Ⅰ和Ⅱ級），并且膠質(zhì)瘤組織的YWHAE的表達明顯高于正常組織。與對照細胞系GES-1相比，膠質(zhì)瘤細胞系(LN229，U87和U251)中YWHAE的表達明顯增高。
　　 第三部分、miR-451對膠質(zhì)瘤細胞系（LN229，U87和U251）YWHAE表達的影響。本實驗將膠質(zhì)瘤細胞系（

12、LN229，U87和U251）分成三組，未作任何處理的為對照組，轉(zhuǎn)染無義序列的為scamble組和轉(zhuǎn)染miR-451 mimics的為處理組。利用Real-time PCR檢測miR-451的轉(zhuǎn)染效率以及miR-451在mRNA水平對YEHAE基因表達的影響，利用western blot檢測miR-451對YWHAE基因表達的影響，利用雙熒光素酶報告實驗驗證YWHAE基因是否為miR-451的直接作用靶點。結(jié)果顯示，miR-451可以明

13、顯抑制YWHAE基因的表達，但是在mRNA水平對YWHAE的表達無顯著影響，熒光素酶實驗顯示較control組、scramble組及pEZX-MT01-YWHAE-3'UTR-Mut組相比，共轉(zhuǎn)染has-miR-451 mimics和pEZX-MT01-YWHAE-3'UTR-wild質(zhì)粒組相對熒光強度顯著降低(P＜0.01)。故可推斷YWHAE是miR-451直接作用靶基因。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過蛋白組學，本課

14、題組成功預測出18種miR-451的可能的直接作用基因，其中包括YWHAE基因。
　　 2、與正常組織相比，YWHAE基因在膠質(zhì)瘤組織中高表達，并且在高級別膠質(zhì)瘤（WHO分級）組織中的表達高于低階別膠質(zhì)瘤。與對照細胞系GES-1相比，YWHAE基因在膠質(zhì)瘤細胞系中亦是高表達的。
　　 3、在膠質(zhì)瘤細胞系（LN229，U87和U251）中miR-451可以明顯抑制YWHAE基因的表達，但是在mRNA水平對YWHAE基因的表