PKIP-miR-98在膠質(zhì)瘤生長轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用研究.pdf

1、目的:
　　膠質(zhì)瘤是最常見的腦內(nèi)原發(fā)性的腫瘤，其發(fā)病率在所有顱內(nèi)腫瘤中居第一位。其中，Ⅳ型膠質(zhì)瘤的惡性程度最強(qiáng)。盡管目前臨床上普遍開展了手術(shù)、放療、化療等多種治療方法，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然較差，其5年生存率大約10％。由于Ⅳ型膠質(zhì)瘤的侵襲性很強(qiáng)，對(duì)現(xiàn)有化療藥物普遍存在耐藥性，所以迫切需要更多的研究來優(yōu)化治療手段。探索膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的新治療靶點(diǎn)，可能為提高膠質(zhì)瘤的臨床治療效果帶來希望。有研究表明，RAS/RAF信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤的

2、發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。其中，Raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1kinase inhibitor protein，RKIP)屬于磷脂酰乙醇胺家族的一員，參與調(diào)控惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)，RKIP能通過抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信號(hào)通路的活性，從而抵消這兩條信號(hào)通路促生存、抗凋亡的作用，最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長。過表達(dá)RKIP可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。然而，RKIP在膠質(zhì)瘤中的作用及相關(guān)機(jī)制，目前尚不清

3、楚。
　　MicroRNA是一類長度大約為19-25個(gè)核糖核酸的小分子RNA，自從1998年在線蟲上首次發(fā)現(xiàn)后，其表達(dá)和功能逐漸被廣為關(guān)注。MicroRNA并不編碼蛋白，而是通過直接結(jié)合其靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，抑制mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解，因此可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)。近年來，microRNA在惡性膠質(zhì)瘤中潛在的診斷和治療作用吸引了越來越多的關(guān)注。諸多研究表明，microRNA參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存、

4、凋亡、增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移、侵襲和血管生成等生物學(xué)過程。另外，膠質(zhì)瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中，microRNA表達(dá)存在明顯的差異，提示microRNA有可能作為診斷膠質(zhì)瘤的重要工具。最近有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-98很可能在包括前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥性中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，然而，其在膠質(zhì)瘤中的作用尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)HMGA2是microRNA-98的靶基因。HMGA2是高遷移率蛋白家族A(

5、high-mobility group A)的一員，能通過影響轉(zhuǎn)錄因子的活性參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而，HMGA2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用尚不明確。
　　本課題旨在探明RKIP在膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移中所發(fā)揮的作用可能與microRNA-98調(diào)控的HMGA2密切相關(guān)。首先我們收集了26例膠質(zhì)瘤標(biāo)本，對(duì)RKIP在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)顯著下調(diào)，提示其在膠質(zhì)瘤中可能起到重要作用。之后，我們進(jìn)一步研究了

6、RKIP與microRNA-98在膠質(zhì)瘤中的關(guān)系，以及microRNA-98與HMGA2的靶向關(guān)系。
　　方法:
　　收集26例不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，U87，SHG44，以癌旁組織或膠質(zhì)細(xì)胞HEB為對(duì)照，分別利用Real-time PCR和Western Blotting檢測(cè)RKIP、microRNA-98和HMGA2在正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平。
　　(1)利用雙熒光素

7、酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證microRNA-98與HMGA2的靶向調(diào)控關(guān)系。
　　(2)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251細(xì)胞中，利用慢病毒過表達(dá)RKIP，用Western Blotting驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率后，利用Real-time PCR檢測(cè)microRNA-98的表達(dá)水平，用Western Blotting檢測(cè)HMGA2的表達(dá)水平。
　　(3)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251細(xì)胞中，過表達(dá)RKIP后，用BrdU檢測(cè)U87、U251細(xì)胞增殖能力的改

8、變。
　　(4)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251細(xì)胞中，過表達(dá)RKIP后，用Transwell檢測(cè)U87、U251細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　(5)利用microRNA-98 mimic轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251細(xì)胞，利用Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;同時(shí)過表達(dá)RKIP，利用Real-timePCR檢測(cè)microRNA-98的表達(dá)水平。
　　(6)設(shè)置分組:對(duì)照組、過表達(dá)RKIP組、microRNA-98+RK

9、IP共轉(zhuǎn)組，用Western Blotting檢測(cè)HMGA2的表達(dá)。
　　(7)設(shè)置分組:對(duì)照組、過表達(dá)microRNA-98組、過表達(dá)RKIP組、microRNA-98+RKIP共轉(zhuǎn)組。用BrdU檢測(cè)U87、U251細(xì)胞增殖能力的改變;用Transwell檢測(cè)U87、U251細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　(1)與癌旁組織相比，膠質(zhì)瘤組織中RKIP和microRNA-98的表達(dá)水平顯著降低，而HMGA2的表達(dá)水

10、平則顯著升高。其中，microRNA-98和RKIP具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，而microRNA-98與HMGA2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　(2)與正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44、U251、U87中RKIP和microRNA-98的表達(dá)水平顯著降低，而HMGA2的表達(dá)水平則顯著升高，尤其在U251、U87細(xì)胞中差異最為明顯。
　　(3)雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，microRNA-98可以直接結(jié)合HMGA2 mRNA

11、的3'-UTR區(qū)。
　　(4)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251細(xì)胞中，過表達(dá)RKIP后，microRNA-98的表達(dá)顯著上調(diào)，而HMGA2的表達(dá)則顯著降低，細(xì)胞增殖無明顯改變，而侵襲能力下降。
　　(5)與單獨(dú)轉(zhuǎn)染microRNA-98 mimic相比，共轉(zhuǎn)染microRNA-98+RKIP后，U87、U251細(xì)胞中microRNA-98的表達(dá)水平進(jìn)一步升高。
　　(6)與單獨(dú)轉(zhuǎn)染RKIP相比，共轉(zhuǎn)染microRNA-98

12、+RKIP后，U87、U251細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)進(jìn)一步降低。
　　(7)與單獨(dú)轉(zhuǎn)染RKIP或microRNA-98相比，共轉(zhuǎn)染microRNA-98+RKIP后，并未顯著影響U87、U251細(xì)胞的增殖水平。
　　(8)與單獨(dú)轉(zhuǎn)染RKIP或microRNA-98相比，共轉(zhuǎn)染microRNA-98+RKIP后，U87、U251細(xì)胞侵襲能力進(jìn)一步減弱。
　　結(jié)論:
　　(1) RKIP與microRNA-98在膠質(zhì)

13、瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低。
　　(2) RKIP與microRNA-98在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。
　　(3)過表達(dá)RKIP可上調(diào)microRNA-98的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖無明顯影響，但可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　(4) HMGA2在膠質(zhì)瘤組織和和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)顯著升高。
　　(5) HMGA2與microRNA-98在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　(6) microRNA-