miR-98通過(guò)IKKε調(diào)控NF-κB通路在膠質(zhì)瘤侵襲中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究以不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織和U87、U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)miR-98與IKKε在腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)性，進(jìn)一步探討miR-98介導(dǎo)IKKε/NF-κB通路的調(diào)控機(jī)制及與腦膠質(zhì)瘤侵襲性生物學(xué)行為的關(guān)系，以期為膠質(zhì)瘤的防治提供新的思路。
　　方法：
　　1.第一步通過(guò)Real-Time PCR、Western blot方法檢測(cè)53例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本、10例正常腦組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)

2、胞中的miR-98與IKKε、NF-κB p65的表達(dá)水平，初步探究分析miR-98與IKKε、NF-κB在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性。
　　2.第二步采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)miR-98與IKKε之間的調(diào)控關(guān)系。
　　3.第三步研究人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響及IKKε/NF-κB表達(dá)的體外研究,并初步探討其潛在機(jī)制。
　　a.采用miR-98 mimics轉(zhuǎn)染U87及U251膠

3、質(zhì)瘤細(xì)胞，采用Real time PCR檢測(cè)miR-98及IKKε、MMP-9 mRNA的表達(dá)，采用Western blot檢測(cè)IKKε、細(xì)胞總NF-κB p65及細(xì)胞核中NF-κB p65、MMP-9蛋白表達(dá)；
　　b.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后侵襲能力的改變，劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染miR-98 mimics后細(xì)胞遷移能力的改變。
　　4.第四步研究在腦膠質(zhì)瘤中IKKε及NF-κB p65在miR

4、-98調(diào)控中的作用的體外研究，并進(jìn)一步驗(yàn)證其機(jī)制
　　a. pcDNA3/IKKε及miR-98 mimics共轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，Western blot檢測(cè)IKKε、MMP-9、細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況。采用Real time PCR檢測(cè)IKKε、MMP-9 mRNA的表達(dá)；
　　b.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的改變，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的改變。
　　c.

5、 pcDNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics共轉(zhuǎn)染U87及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞， Western blot檢測(cè)細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的表達(dá)情況；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的改變，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力的改變。
　　結(jié)果：
　　1、腦膠質(zhì)瘤中miR-98、IKKε、NF-κB p65的表達(dá)相關(guān)性
　　a. miR-98表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤組織病理級(jí)別呈負(fù)相關(guān)；IKKε、

6、NF-κB P65表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤組織病理級(jí)別呈正相關(guān)。
　　b. miR-98與IKKε表達(dá)水平呈密切負(fù)相關(guān)（r2=0.7223，p<0.05），miR-98與NF-κB P65表達(dá)水平呈密切負(fù)相關(guān)（r2=0.6337，p<0.05）；NF-κB P65與IKKε表達(dá)水平呈密切正相關(guān)（r2=0.6123，p<0.05）
　　2、U251、U87細(xì)胞較HEB細(xì)胞miR-98表達(dá)下降，IKKε表達(dá)增高；熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示：轉(zhuǎn)染

7、miR-98 mimics后，IKKε-WT報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度受到顯著抑制；而IKKε-MUT報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度基本不變，說(shuō)明IKKεmRNA的3’UTR上存在miR-98的結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)IKKε是miR-98下游靶基因。
　　3、轉(zhuǎn)染miR-98 mimics發(fā)現(xiàn)：a.上調(diào)miR-98能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力。b.上調(diào)miR-98表達(dá)能夠下調(diào)IKKε的表達(dá)水平及抑制NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)座，從而調(diào)控NF

8、-κB通路及抑制MMP-9的表達(dá)水平，而不影響NF-κB p65在細(xì)胞中的總含量。
　　4、轉(zhuǎn)染pcDNA3/IKKε及miR-98 mimics發(fā)現(xiàn)：a.上調(diào)IKKε能夠恢復(fù)因轉(zhuǎn)染miR-98 mimics而降低的腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力；b.上調(diào)IKKε能恢復(fù)NF-κB p65的轉(zhuǎn)座從而調(diào)控NF-κB通路及恢復(fù)MMP-9的表達(dá)水平。
　　5、轉(zhuǎn)染IKKεsiRNA+miR-98 mimics與IKKεsiRNA+miR-9

9、8 inhibitor發(fā)現(xiàn)：抑制 IKKε表達(dá)后 miR-98 mimics及 miR-98 inhibitor對(duì) NF-κB p65的轉(zhuǎn)座及MMP-9的表達(dá)無(wú)差別。
　　6、轉(zhuǎn)染pcDNA3/NF-κB p65及miR-98 mimics發(fā)現(xiàn)：上調(diào)NF-κB p65能夠恢復(fù)因轉(zhuǎn)染miR-98 mimics而降低的腦膠質(zhì)瘤侵襲與遷移能力
　　結(jié)論：
　　miR-98可以通過(guò)IKKε基因調(diào)控NF-κB通路，影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)