“GLI-miR-124-AURKA”調(diào)控模型的構建及其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用.pdf

1、研究背景:
　　Hedgehog信號通路在調(diào)控細胞生長、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在生殖細胞中Hh信號轉(zhuǎn)導通路的異常激活往往造成發(fā)育過程紊亂;在體細胞中Hh信號轉(zhuǎn)導通路的異?；罨瘎t往往伴隨多種癌癥的發(fā)生。腫瘤是在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下,細胞周期紊亂和細胞生長失控所致的一類疾病。大量研究表明:腫瘤發(fā)生的關鍵在于腫瘤相關基因的轉(zhuǎn)錄失控。某些蛋白作為反式作用因子( trans acting factors)與其他基因

2、的順式作用元件( cis acting elements)相互作用,實現(xiàn)對腫瘤相關基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。因此,深入研究腫瘤相關基因的反式作用因子有助于我們了解腫瘤相關基因的表達調(diào)控機制。
　　轉(zhuǎn)錄因子GLI(Glioma-associated oncogene transcription factors, GLI)位于Hh信號通路級聯(lián)傳導的末端,是通路上的關鍵調(diào)控因子,在信號傳導中起樞紐作用。研究表明GLI功能異常可能參與多種腫瘤發(fā)

3、生發(fā)展,但調(diào)控機制有待明晰。有研究報道抑制GLI能降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖與侵襲能力,基因芯片結果也證實GLI抑制的癌細胞中microRNAs的表達發(fā)生類似改變,提示受其調(diào)控的microRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　研究目的:
　　1.本課題以 GLI為研究靶標,根據(jù)生物信息學方法預測具有GLI結合元件的microRNAs,結合基因芯片數(shù)據(jù),采用實時定量PCR及Western Blot等手段,證明

4、miR-124為受GLI調(diào)控的microRNA,并確定AURKA為其下游靶基因,從而建立“GLI/miR-124/AURKA”信號軸。
　　2.研究與神經(jīng)膠質(zhì)瘤密切相關的microRNAs,特別是miR-124的功能,從分子、細胞和臨床水平三個層面分別驗證“GLI/miR-124/AURKA”信號軸的正確性,揭示“GLI/miR-124/AURKA”信號軸與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關系,豐富Hh-GLI信號網(wǎng)絡的調(diào)控機制,為尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤診療

5、新靶點提供理論依據(jù)。
　　研究內(nèi)容:
　　1.前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)在GANT61處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中許多重要信號通路相關基因的表達發(fā)生顯著改變,利用生物信息學方法對在 GLI抑制條件下的差異表達基因進行 GLI結合位點預測分析,發(fā)現(xiàn)存在一定數(shù)量的差異表達基因不含有已知的GLI蛋白轉(zhuǎn)錄結合區(qū)域,因此我們提出“轉(zhuǎn)錄因子/microRNAs/間接靶基因”的調(diào)控模型。
　　2.利用特異性小分子抑制劑下調(diào) GLI的表達后,通過

6、基因芯片技術分析microRNAs表達譜變化;同時用生物信息學方法對差異表達的microRNAs進行歸類分析;采用實時定量PCR技術對富集于某些信號通路的差異microRNAs進行驗證。通過分析microRNAs表達譜芯片發(fā)現(xiàn),經(jīng)GANT61處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中,miR-519a、miR-335和miR-124等microRNAs表達水平升高,經(jīng)過多重驗證后,我們優(yōu)先選取miR-124進行后續(xù)的功能研究。
　　3.采用多個數(shù)

7、據(jù)庫(TargetScan算法、基于序列互補的miRanda、基于熱力學模型的PicTar)預測,結合基因芯片差異表達譜結果分析,選定AURKA作為miR-124的下游靶基因,電轉(zhuǎn)染法高表達miR-124后檢測下游靶基因的變化(包括mRNA水平和蛋白水平等方面),對受microRNAs調(diào)控的靶基因進行驗證。
　　4.在H4細胞中,通過GLI的特異性抑制劑GANT61處理、干擾質(zhì)粒下調(diào)GLI2和高表達miR-124等手段,檢測相應組

8、分的mRNA水平及蛋白水平的變化情況,驗證并確立“GLI/miR-124/AURKA”信號軸的正確性,采用流式細胞儀檢測信號軸對細胞周期的影響。
　　5.在臨床樣本水平上,通過免疫組化法以及 Western Blot法檢測 GLI2與AURKA的表達水平,分析二者相關性,揭示出“GLI/miR-124/AURKA”信號軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。
　　研究結果:
　　1. Hedgehog信號通路中存在“GLI