Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對(duì)水通道蛋白AQP1調(diào)控作用的研究.pdf

1、本研究共分兩個(gè)部分 第一部分： 研究背景和目的： Hedgehog(Hh)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起至關(guān)重要作用的一條信號(hào)通路，其在胚胎早期可以通過(guò)通路各組分不同時(shí)間、空間的特異性表達(dá)對(duì)多種細(xì)胞的命運(yùn)決定產(chǎn)生影響，并且可以與Wnt、FGFs、BMPs等信號(hào)通路產(chǎn)生相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞定向分化的精細(xì)調(diào)節(jié)。Hedgehog信號(hào)的調(diào)節(jié)紊亂在胚胎期會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙和畸形，在已經(jīng)成熟的個(gè)體則會(huì)

2、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Glil(Glioma-associated Oncogene Homolog l，Glil)最初是在研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)基因，其編碼的Glil蛋白是Hh信號(hào)途徑最重要的下游轉(zhuǎn)錄因子之一，也是Hh信號(hào)最終的響應(yīng)者和功能的執(zhí)行者。Hh-Glil信號(hào)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中處于一種調(diào)節(jié)紊亂的異常激活狀態(tài)，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其上游配體Shh信號(hào)的存在對(duì)于膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)及腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力的維持有著重要

3、作用，其下游轉(zhuǎn)錄因子Glil可以通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinDl，Bcl-2的表達(dá)水平參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，同時(shí)也與膠質(zhì)瘤的惡性程度和惡性生物學(xué)行為的維持密切相關(guān)。 Aquaporins(水通道蛋白，AQPs)是一類分布在細(xì)胞膜表面，能夠特異的對(duì)水分子進(jìn)行快速高效跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的小分子通道蛋白家族。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布的水通道蛋白是AQP1。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)AQPs與神經(jīng)系統(tǒng)的一些疾病尤其是腫瘤性疾病的進(jìn)展有著密切的關(guān)系，AQP1

4、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲生長(zhǎng)及瘤周組織的腦水腫形成方面都發(fā)揮了重要的作用，雖然已經(jīng)有大量的研究闡明了AQP1是如何通過(guò)自身的通道結(jié)構(gòu)對(duì)水分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的，但是對(duì)其本身表達(dá)水平的高低受何種機(jī)制的調(diào)控尤其是它與主要信號(hào)通路之間的關(guān)系仍然知之其少。 本研究擬從一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤-神經(jīng)膠質(zhì)瘤入手，研究Hedgehog通路的異常激活與水通道蛋白AQP1之間的關(guān)系，旨在證明Hedgehog通路下游轉(zhuǎn)錄因子Glil對(duì)AQP1的

5、表達(dá)具有調(diào)控作用，闡明這種調(diào)控是在何種水平、以何種方式進(jìn)行，并對(duì)這種調(diào)控作用對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響進(jìn)行了初步探討。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．用免疫組織化學(xué)、免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)和Western blot等方法研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Hedgehog通路的激活情況以及AQP1的表達(dá)情況，并對(duì)兩者之間的相關(guān)程度進(jìn)行分析； 2．構(gòu)建包含AQP1啟動(dòng)子區(qū)全長(zhǎng)的Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒AQP1-Luc-F，將G

6、lil-myc與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Glil對(duì)AQP1-Luc-F激活程度的影響； 3．將Glil過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞，收獲不同時(shí)間點(diǎn)及不同轉(zhuǎn)入劑量的樣品，RT-PCR觀察轉(zhuǎn)錄水平、Western blot觀察蛋白水平AQP1的表達(dá)變化： 4．設(shè)計(jì)合成Glil基因特異的干擾片段，構(gòu)建干擾載體，體外驗(yàn)證有效后，研究干擾掉Glil后對(duì)AQP1報(bào)告基因活性及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中AQP1表達(dá)的影響； 5．建

7、立分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體、過(guò)表達(dá)Glil、及穩(wěn)定干擾Glil的三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系：L1251-PC3.1，U251-Glil，L1251-PGl，Western Blot方法檢測(cè)三種細(xì)胞系中AQP1表達(dá)水平的變化； 6．將報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入三種不同的穩(wěn)定細(xì)胞系中，檢測(cè)AQP1轉(zhuǎn)錄活性的變化； 7．分析AQP1啟動(dòng)子區(qū)，根據(jù)Glil的核心結(jié)合序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChiP)技術(shù)研究Glil與AQP1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況

8、； 8．根據(jù)ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建AQP1啟動(dòng)子區(qū)突變報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的穩(wěn)定細(xì)胞系中，利用報(bào)告基因檢測(cè)確定在Glil對(duì)AQP1調(diào)控中起關(guān)鍵作用的啟動(dòng)子區(qū)段位置，闡明調(diào)控作用的機(jī)制； 9．利用Transwell和Wound healing assay實(shí)驗(yàn)比較不同細(xì)胞系侵襲能力的差異，評(píng)價(jià)Glil在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中調(diào)控AQP1表達(dá)所引起的生物學(xué)功能變化。 結(jié)論： 本研究首次發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)

9、膠質(zhì)瘤中Hedgehog通路異?；罨cAQP1異常高表達(dá)兩種現(xiàn)象之間的關(guān)系，并且證實(shí)Hh通路下游轉(zhuǎn)錄因子Glil可以通過(guò)與AQP1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其中AQP1啟動(dòng)子區(qū)-06--398段的DNA序列在這一調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中這一調(diào)控作用的生物學(xué)意義是：Glil可以通過(guò)上調(diào)AQP1來(lái)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性侵襲能力。 第二部分： 研究背景和目的： Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

10、通路(Hh通路)是一條高度保守的，在生物的胚胎發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用的信號(hào)通路。近年來(lái)的研究表明，在多種人類惡性腫瘤性疾病中(如腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等)該通路都呈現(xiàn)出異常的活化狀態(tài)，并且對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)生后腫瘤組織的生長(zhǎng)和惡性生物學(xué)特性的維持起著重要作用。人們?cè)谘芯縃h通路與腫瘤之間關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，特異性抑制Hh通路可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖以及向其他器管侵襲轉(zhuǎn)移的能力。因此，Hedge

11、hog信號(hào)通路被認(rèn)為是一條比較理想的可以作為腫瘤靶向治療的信號(hào)途徑，針對(duì)Hh通路的小分子抑制劑的開(kāi)發(fā)及研究工作方興未艾，逐漸成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。 Jervine(介芬胺)是從藜蘆屬植物中提取的一種小分子天然產(chǎn)物，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于一種甾體類生物堿。Jervine可以與Hh通路上游激活因子Smo特異性結(jié)合而抑制該通路信號(hào)的傳遞，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的效應(yīng)，是一種具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的小分子抑制劑。但是Jervine作為一種天

12、然產(chǎn)物，其抑制Hh通路活性的作用并不是很強(qiáng)且具有較大的化學(xué)毒性，這一缺陷限制和延緩了其作為一種新型抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用。 本研究擬以Jervine為先導(dǎo)化合物，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾和改造的方法制備系列目標(biāo)衍生物；然后對(duì)制備的衍生物進(jìn)行抑制Hh通路的特異性篩選及抗腫瘤活性篩選，并與已有的Hedgehog通路抑制劑的活性進(jìn)行比較，最終期望獲得一到兩個(gè)高效、低毒、高特異性的Hedgehog通路抑制劑，并對(duì)結(jié)構(gòu)修飾規(guī)律作出總結(jié)，為新型抗腫瘤藥

13、物的研發(fā)提供基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．結(jié)構(gòu)修飾衍生物的獲得：以Jervine為底物，分別經(jīng)醚化、N-烴化、N-?；琋-甲基化、3-OH氯代等特異性化學(xué)修飾得到一系列衍生化合物； 2．衍生物高通量篩選平臺(tái)的構(gòu)建：在Hh通路組成性激活的NIH/3T3細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以反應(yīng)Hh通路激活程度的報(bào)告基因Hh-reporter，將該細(xì)胞系命名為NIH/3T3-R，并對(duì)該細(xì)胞系反映Hh通路激活程度的敏感性進(jìn)行鑒定；

14、3．初次篩選：以步驟2中構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系為篩選工具，將步驟1中得到的衍生物以8uM濃度作用于體外培養(yǎng)的C3H-3T3-R，36h后測(cè)定報(bào)告基因數(shù)值，觀察各化合物對(duì)Hh通路的抑制效應(yīng)，得到可以相對(duì)特異性抑制Hh通路活性的化合物； 4．二次篩選：細(xì)胞活性檢測(cè)再次篩選步驟3中得到的化合物對(duì)體外培養(yǎng)的NIH/3T3-R的細(xì)胞毒性，排除初篩過(guò)程中報(bào)告基因數(shù)值的降低是由于化合物本身的毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡所致，得到對(duì)細(xì)胞增殖抑制不明顯，但可以顯著

15、抑制報(bào)告基因活性的毒性低、特異性好的衍生物； 5．RT-PCR及Western blot檢測(cè)步驟4中得到的化合物對(duì)NIH/3T3細(xì)胞中Hh通路下游轉(zhuǎn)錄因子Glil表達(dá)的抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證化合物的特異性； 6．CCK8法檢測(cè)經(jīng)二次篩選得到的衍生物在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)，將得到的化合物以不同劑量灌胃給藥，觀察其對(duì)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用；最終得到具有較高的抗腫瘤活性、低毒高效的Hh通路抑制劑；

16、結(jié)論： 本研究以Jervine為先導(dǎo)化合物，首先經(jīng)特異性結(jié)構(gòu)修飾改造得到一系列衍生物，然后對(duì)衍生物在抑制Hh通路的特異性、體內(nèi)外毒性、抗腫瘤活性等方面的特性進(jìn)行連續(xù)篩選，最終得到四個(gè)特異性較好、毒性較低、抗腫瘤活性較強(qiáng)的陽(yáng)性化合物，其中有三個(gè)化合物在上述特性上與陽(yáng)性對(duì)Cyclopamine(環(huán)杷明)類似，一個(gè)化合物要優(yōu)于環(huán)杷明。對(duì)所得陽(yáng)性化合物的結(jié)構(gòu)改造位點(diǎn)與先導(dǎo)化合物Jervine的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析可以得出以下規(guī)律：3-OH氧