Sumo化修飾在Hedgehog信號通路轉(zhuǎn)錄因子Gli2活性調(diào)節(jié)中的作用研究.pdf

1、分泌型Hedgehog(Hh)家族在脊椎動物和非脊椎動物的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。脊椎動物Hh信號功能的缺失導(dǎo)致很多發(fā)育畸形，包括前腦無裂畸形、多指/趾畸形、顱面缺損和骨骼形成缺損。同時(shí)，Hh信號通路的異常激活也與很多類型的人類惡性腫瘤有關(guān)，如腦膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、食管癌、直腸癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。因此全面了解Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，不僅可以闡明胚胎發(fā)育的分子機(jī)制，同時(shí)也可以預(yù)防和治療Hh相關(guān)的腫瘤。
　

2、　 在脊椎動物，Hh配體與細(xì)胞表面的受體Patched(Ptch)結(jié)合，這一結(jié)合可阻止Ptch對Smoothened(Smo)蛋白的抑制，從而允許Hh通路得以激活。Hh信號通路有3個(gè)Gli轉(zhuǎn)錄因子對其進(jìn)行調(diào)節(jié):Glil、Gli2、Gli3。其中，Gli2、Gli3具備雙重轉(zhuǎn)錄活性，在有Hh信號存在時(shí)為激活狀態(tài)(Gli2A/Gli3A)，在無Hh信號時(shí)經(jīng)蛋白酶水解加工成為抑制狀態(tài)(Gli2R/Gli3R)。Gli1是Gli2A/Gli3

3、A的直接作用轉(zhuǎn)錄基因，只具有激活子功能。Gli2是調(diào)節(jié)Hh信號通路的主要的轉(zhuǎn)錄激活子。目前，Hh信號和蛋白修飾物如何調(diào)節(jié)Gli蛋白的功能尚未得到完全了解。
　　 小泛素樣修飾蛋白（Sumo）是一個(gè)有100個(gè)氨基酸的多肽，可通過與泛素化類似的方式與靶蛋白共價(jià)結(jié)合。Sumo修飾對靶蛋白的功能有多種效應(yīng)。比如，轉(zhuǎn)錄因子Sumo化修飾之后大多會使轉(zhuǎn)錄過程受抑制，但是偶爾也會發(fā)現(xiàn)它有激活轉(zhuǎn)錄過程的效應(yīng)。
　　 本次研究通過細(xì)胞培養(yǎng)

4、實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)基因小鼠在體實(shí)驗(yàn)，探討了Sumo與Gli2轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性、Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響及影響這一修飾的因素及作用機(jī)制。
　　 第一章Sumo與轉(zhuǎn)錄因子Gli2的相關(guān)性研究
　　 第一節(jié)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Gli2蛋白與Sumo的相關(guān)性研究
　　 [目的]
　　 探究在體內(nèi)可與Gli2蛋白相互作用的修飾蛋白，證實(shí)Gli2蛋白可以發(fā)生Sumo化修飾。
　　 [方法]
　　 取胎齡

5、10.5天的野生型小鼠胚胎肢芽，將其中的信使RNA（mRNA）分離出來，反轉(zhuǎn)錄得到野生型小鼠肢芽cDNA文庫，將其重組入Pjg4-5載體。用Gli2蛋白羧基末端片段Gli2-584-1024aa來構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pNlex-Gli2-584-1024aa，使用酵母雙雜合篩選法篩選小鼠肢芽cDNA文庫，尋找可與Gli2相互作用的修飾蛋白。
　　 [結(jié)果]
　　 通過酵母雙雜合系統(tǒng)篩選胎鼠肢芽cDNA文庫得到兩個(gè)基因編碼的蛋白可

6、與Gli2相互作用，它們是Sumo2和Pias1（一個(gè)SumoE3結(jié)合酶）。通過該實(shí)驗(yàn)證實(shí)在體內(nèi)Gli2蛋白存在Sumo化修飾。
　　 [討論]
　　 哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，通過免疫共沉淀方法未能證實(shí)Gli2與Sumo2或Pias1存在相互作用，提示我們，這一相互作用過程很短暫。
　　 第二節(jié)HEK293培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)Gli2蛋白與Sumo的相關(guān)性研究
　　 [目的]
　　 探究在體外培養(yǎng)細(xì)胞中G

7、li2蛋白是否發(fā)生Sumo化修飾，在PDD(Gli2羧基端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域-processingdeterminantdomain蛋白加工決定域)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的兩個(gè)Sumo化位點(diǎn)是否被Sumo修飾。
　　 [方法]
　　 1、將HA標(biāo)記的Sumo2基因HA-Sumo2、Gli2基因分別單獨(dú)及共同在細(xì)胞中表達(dá)，將細(xì)胞裂解提取蛋白，使用Gli2抗體對細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀作用，使用HA抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞中Sumo與Gli2

8、蛋白是否存在相互作用;
　　 2、將UBC9基因（E2Sumo結(jié)合酶）和UBC9DN基因(UBC9的負(fù)性結(jié)構(gòu))分別與HA-Sumo2基因、Gli2基因一起在細(xì)胞中表達(dá)，將細(xì)胞裂解提取蛋白，使用Gli2抗體對細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀作用，使用HA抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測有無Sumo結(jié)合酶基因共表達(dá)的細(xì)胞中Sumo化的Gli2蛋白表達(dá)量是否有區(qū)別;
　　 3、將GST融合野生型PDD基因、變異型PDD基因(PDD中兩個(gè)Sumo

9、化位點(diǎn)突變)分別與HA-Sumo2基因一起在細(xì)胞中表達(dá)，將細(xì)胞裂解提取蛋白，經(jīng)GST融合蛋白沉降技術(shù)沉降蛋白，使用HA抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測有無Sumo化位點(diǎn)突變的PDD基因共表達(dá)的細(xì)胞中Sumo化的Gli2蛋白表達(dá)量是否有區(qū)別。
　　 [結(jié)果]
　　 1、只有當(dāng)HA-Sumo2與Gli2在細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)才能檢測到Sumo化的Gli2蛋白的免疫反應(yīng)信號，各自單獨(dú)表達(dá)時(shí)則不能;
　　 2、將UBC9與Gli2、

10、Sumo2共表達(dá)時(shí)可顯著提高Gli2蛋白Sumo化修飾的水平，而UBC9DN與上述兩個(gè)基因共表達(dá)時(shí)則完全抑制Gli2蛋白Sumo化修飾;
　　 3、Gli2蛋白Sumo化修飾在野生型PDD表達(dá)的細(xì)胞可以監(jiān)測到，但在單個(gè)或兩個(gè)Sumo化位點(diǎn)突變的變異型PDD表達(dá)的細(xì)胞Sumo化修飾顯著減少或徹底消失。
　　 [討論]
　　 因?yàn)槊庖叱恋矸磻?yīng)發(fā)生在蛋白變性以后，所以實(shí)驗(yàn)1中檢測到的信號應(yīng)該是Sumo化修飾的Gli2，

11、而不是與Gli2相互關(guān)聯(lián)的蛋白;實(shí)驗(yàn)2表明Gli2蛋白Sumo化修飾是特異性的;實(shí)驗(yàn)3表明在細(xì)胞內(nèi)PDD結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)Sumo化位點(diǎn)被Sumo修飾。
　　 第二章體內(nèi)外研究中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　 第一節(jié)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　 [目的]
　　 探究Sumo化修飾在體內(nèi)Hh信號通路中的作用及在體內(nèi)對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 [方法

12、]
　　 制備攜帶變異型Gli2基因Gli2K2R的突變小鼠（將Gli2K630、K716位置的Sumo化位點(diǎn)突變），選取野生型和突變型El0.5胚胎，提取蛋白，用包含特異的Gli結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸將Gli2蛋白富集濃縮，免疫印跡分析使用Gli2抗體，檢測該突變小鼠體內(nèi)Gli2蛋白加工過程是否受影響;其次測定發(fā)育中的胎鼠神經(jīng)管上神經(jīng)元細(xì)胞的特異性分化和圖式發(fā)育（該過程與Hh信號通路有密切關(guān)系）:雌鼠受孕10.5天后，將其處死

13、，取胚胎固定、包埋，制備冰凍切片，使用相應(yīng)抗體對組織切片行免疫染色，熒光顯微鏡下觀察切片。
　　 [結(jié)果]
　　 1、成功制備Gli2K2R突變小鼠后，檢測突變小鼠體內(nèi)Gli2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明突變體Gli2K2R與野生型Gli2蛋白表達(dá)水平相當(dāng)。
　　 2、在野生型胚胎，底板、V3祖細(xì)胞、運(yùn)動神經(jīng)元在腹側(cè)神經(jīng)管的特定區(qū)域特化和圖式發(fā)育。他們分別可被轉(zhuǎn)錄因子FOXA2，NKX2.2，andHB9andISl1

14、表達(dá)標(biāo)記。NKX6.1的表達(dá)從底板覆蓋至V1祖細(xì)胞。與此相反，PAX6、PAX7的表達(dá)位于背側(cè)神經(jīng)管，他們兩個(gè)分別在腹側(cè)神經(jīng)管的大部分和全部區(qū)域表達(dá)缺失，因?yàn)樗麄兊谋磉_(dá)被Hh信號抑制。與野生型胚胎相比，這些轉(zhuǎn)錄因子在突變型Gli2K2R純合子胚胎神經(jīng)管上的表達(dá)和圖式發(fā)育無明顯差別。使用lacZ報(bào)告基因嵌入Ptch1位置，Ptch1-lacZ在Gli2突變型胚胎神經(jīng)管上的表達(dá)與野生型Gli2胚胎相比輕微增高，并且在背側(cè)分布更廣。
　

15、　 [討論]
　　 Ptch1是Gli2轉(zhuǎn)錄作用的靶基因，Ptch1表達(dá)增強(qiáng)表明Gli2轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。因此，該實(shí)驗(yàn)表明在小鼠體內(nèi)，突變型Gli2K2R活性比野生型Gli2輕微增高，表明在體內(nèi)Sumo化修飾抑制Gli2轉(zhuǎn)錄活性。
　　 第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)研究中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　 [目的]
　　 使用雞胚肢芽原代細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)，體外實(shí)驗(yàn)中測定Sumo修飾對于Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響

16、。
　　 [方法]
　　 制備攜帶兩個(gè)Sumo化位點(diǎn)K630、K716單個(gè)或全部突變的變異型Gli2基因的載體質(zhì)粒(pRKGli2K630R、pRKGli2K716R、pRKGli2K630/716R)，將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、海腎熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒、pRK-Gli2及上述攜帶變異Gli2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入雞胚肢芽微團(tuán)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)36小時(shí)后裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測盒檢測各類轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶活性，與海腎熒光素酶活

17、性標(biāo)準(zhǔn)化后，繪制熒光素酶相對活性圖表。
　　 [結(jié)果]
　　 過度表達(dá)的野生型Gli2蛋白使報(bào)告基因活性增高約10倍，Gli2K630R、Gli2K716R蛋白使報(bào)告基因活性增高的程度比野生型Gli2蛋白輕微增高，而Gli2K630/716R蛋白使報(bào)告基因活性增高約30余倍。
　　 [討論]
　　 這些結(jié)果表明，Sumo化修飾使Gli2轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。在培養(yǎng)細(xì)胞中，單個(gè)Sumo化修飾位點(diǎn)作用不明顯而各個(gè)

18、Sumo化修飾位點(diǎn)相互協(xié)同，共同作用，對Gli2轉(zhuǎn)錄活性起明顯抑制作用。
　　 第三章Gli2蛋白Sumo化修飾的影響因素及作用機(jī)制研究
　　 第一節(jié)Gli2蛋白Sumo化修飾的影響因素
　　 [目的]
　　 PKA磷酸化可抑制Gli2蛋白活性，而Hh信號可促進(jìn)Gli2蛋白活性激活，因此我們想知道Gli2蛋白Sumo化修飾是否也會受PKA磷酸化和Hh信號的影響。
　　 [方法]
　　 1、

19、使用雞胚肢芽原代細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)，將野生型Gli2基因及6個(gè)磷酸化位點(diǎn)中單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變的變異型Gli2基因分別與HA-Sumo2基因一起在雞胚肢芽微團(tuán)培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，將細(xì)胞裂解提取蛋白，用Gli2抗體對細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀作用，用HA抗體行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，測定不同磷酸化位點(diǎn)突變情況下Gli2蛋白Sumo化修飾水平的變化;
　　 2、將Gli2基因和HA-Sumo2基因單獨(dú)或一起在雞胚肢芽微團(tuán)細(xì)胞中表達(dá)，加入ShhN條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)

20、過夜后裂解細(xì)胞提取蛋白，用Gli2抗體對細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀作用，用HA抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，測定Hh信號對于Gli2蛋白Sumo化修飾水平是否有影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1、在磷酸化位點(diǎn)突變的Gli2基因表達(dá)的細(xì)胞中，與野生型Gli2蛋白Sumo化修飾的水平相比，變異型Gli2P5-6蛋白Sumo化修飾水平略降低，變異型Gli2P1-4蛋白Sumo化修飾水平降低明顯，變異型Gli2P1-6蛋白Sumo化修飾水平降低

21、最為明顯。
　　 2、對表達(dá)Gli2基因和HA-Sumo2基因的細(xì)胞使用ShhN條件培養(yǎng)液，施加Hh信號刺激，與使用普通培養(yǎng)液表達(dá)相同基因的細(xì)胞相比，Gli2蛋白Sumo化修飾水平降低。
　　 [討論]
　　 這些結(jié)果顯示，6個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)的突變和Hh信號刺激都可以抑制Gli2蛋白Sumo化修飾作用，提示我們，PKA對Gli2蛋白的磷酸化過程對Gli2蛋白Sumo化修飾有正性調(diào)節(jié)作用。
　　 第二節(jié)G

22、li2蛋白Sumo化修飾作用機(jī)制的研究
　　 [目的]
　　 探究Sumo化修飾對Gli2轉(zhuǎn)錄活性抑制的分子作用機(jī)制，研究野生型Gli2、突變型Gli2與組蛋白脫乙酰酶(HDACs)之間的相互作用。
　　 [方法]
　　 將野生型Gli2基因和兩個(gè)Sumo化位點(diǎn)突變的變異型Gli2基因Gli2K630/716R與flag標(biāo)記的HDAC4基因和HDAC5基因分別在HEK293細(xì)胞中表達(dá)，將細(xì)胞裂解提取蛋白，

23、各取少量細(xì)胞蛋白分別用Flag抗體和Gli2抗體行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，剩余大部分細(xì)胞蛋白用Gli2抗體行免疫沉淀作用，然后用Flag抗體行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，測定各類基因的蛋白表達(dá)量。
　　 [結(jié)果]
　　 1、HDAC4蛋白表達(dá)水平比HDAC5表達(dá)水平要低。
　　 2、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，Gli2抗體可以沉淀殘余的HDAC5，即便Gli2蛋白沒有過表達(dá)。當(dāng)Gli2與HDAC5共表達(dá)的時(shí)候，HDAC5被沉淀的蛋白量明顯增高。

24、
　　 3、當(dāng)HDAC5與Gli2K630/716R共表達(dá)的時(shí)候，HDAC5被沉淀的蛋白量與其單獨(dú)表達(dá)時(shí)候的蛋白量相近。
　　 4、當(dāng)HDAC4與Gli2或Gli2K630/716R共表達(dá)時(shí)，HDAC4被沉淀的蛋白量相似。
　　 [討論]
　　 與HDAC4相比，Gli2優(yōu)先與HDAC5相結(jié)合。只有Gli2能與HDAC5結(jié)合，而Gli2K630/716R不能與HDAC5相結(jié)合。我們的結(jié)論是Sumo化修飾抑