轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的SUMO化修飾.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESC)是從哺乳類動物著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的能在體外長期培養(yǎng)的多能干細(xì)胞。它可以無限制自我更新并在一定條件下進(jìn)行誘導(dǎo)分化成其它所有類型的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的這些特點(diǎn)使得它基礎(chǔ)研究和臨床治療領(lǐng)域都有重要的價值。然而，我們只有在分子水平闡明其發(fā)育全能性機(jī)制，在應(yīng)用方面才會更加安全、有效。 研究表明，POU 家族轉(zhuǎn)錄因子Oct-4 是影響胚胎干細(xì)胞發(fā)育全能性建立和保持的關(guān)鍵因

2、子。Oct-4 特異表達(dá)于小鼠胚胎發(fā)育過程中的多能和全能性細(xì)胞，在胚胎干細(xì)胞、胚胎腫瘤細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞等未分化的體外培養(yǎng)細(xì)胞中也高表達(dá)。胚胎干細(xì)胞中 Oct-4的表達(dá)水平?jīng)Q定了其生長或分化方向：當(dāng) Oct-4的表達(dá)水平高于正常的2倍時，ES 細(xì)胞向原始內(nèi)胚層與中胚層細(xì)胞方向分化；當(dāng)Oct-4的表達(dá)水平低于正常的 50％時，ES 細(xì)胞則去分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞；只有Oct-4維持在正常水平，ES 細(xì)胞才能維持在自我更新狀態(tài)。但目前調(diào)控 Oct

3、-4表達(dá)和功能的分子機(jī)制尚不清楚。由于體內(nèi)的蛋白經(jīng)常通過蛋白質(zhì)之間的相互作用或形成復(fù)合體發(fā)揮作用，那么篩選與 Oct-4 相互作用的蛋白可為揭示胚胎干細(xì)胞維持發(fā)育全能性的分子機(jī)制提供線索。 我們構(gòu)建了用于酵母雙雜交篩選的ES細(xì)胞cDNA文庫。利用Oct-4的PH結(jié)構(gòu)域作為誘餌蛋白，我們篩選到一個可能與Oct-4相互作用的蛋白-Ubc9。ubc9是 SUMO 化修飾通路中的E2(SUMO結(jié)合酶)，能催化SUMO結(jié)合到底物蛋白的賴氨

4、酸上。GST pull down 和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)Oct-4與Ubc9存在相互作用。在體外、體內(nèi)條件下，Oct-4能被SUMO-1修飾。氨基酸突變實(shí)驗(yàn)顯示，Oct-4的第118位的賴氨酸是SUMO-1結(jié)合的主要位點(diǎn)。分析野生型與SUMO-1結(jié)合位點(diǎn)突變的蛋白穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)SUMO-1位點(diǎn)突變可增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性，表明SUMO-1修飾促使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。檢測體外和體內(nèi)野生與突變蛋白的泛素化水平，顯示SUMO-1 與泛素修飾可能不在同一位點(diǎn)，