ICP4促進(jìn)miR-101表達(dá)及miR-101調(diào)節(jié)HSV-1復(fù)制機(jī)制的研究.pdf

1、【目的】：microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性18～26 nt的單鏈非編碼小分子RNA，在動(dòng)植物體內(nèi)通過靶定編碼基因mRNA3’UTR區(qū)域直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控從而發(fā)揮其基因表達(dá)調(diào)控功能。已有研究表明宿主細(xì)胞 miRNAs參與了病毒感染后的抗病毒免答效應(yīng)，另一方面病毒感染還可引起宿主細(xì)胞內(nèi) miRNAs的表達(dá)升高或降低，宿主細(xì)胞 miRNAs與病毒感染之間存在著密切的相關(guān)性。本項(xiàng)目前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSV-1感染HeLa細(xì)胞后miR

2、-101表達(dá)水平顯著升高，并且初步確定 miR-101通過直接靶定并下調(diào) COX2(Cyclooxygenase2)和GRSF1(G-rich RNA sequence binding factor1)可能對(duì)HSV-1的復(fù)制產(chǎn)生影響。成熟的miR-101有兩個(gè)前體，為pre-miR-101-1和pre-miR-101-2，分別位于1號(hào)和9號(hào)染色體上，本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明HSV-1感染后miR-101的表達(dá)水平升高，以pre-miR-10

3、1-2來源為主。因此本文擬從HSV-1誘導(dǎo)hsa-miR-101-2表達(dá)升高的現(xiàn)象出發(fā)，深入研究HSV-1感染后宿主細(xì)胞hsa-miR-101-2顯著升高的具體機(jī)制，以及 miR-101對(duì) HSV-1復(fù)制的具體調(diào)控作用機(jī)制，深入闡明宿主細(xì)胞 miRNA與HSV-1之間的相互作用關(guān)系。
　　【方法】：本文主要從HSV-1感染后宿主細(xì)胞miR-101顯著升高的具體機(jī)制，以及miR-101對(duì)HSV-1復(fù)制的具體調(diào)控作用機(jī)制兩方面進(jìn)行：<

4、br>　　1.首先通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)確定HSV-1對(duì)hsa-miR-101-2啟動(dòng)子的具體作用方式，確定導(dǎo)致hsa-miR-101-2啟動(dòng)子活性變化的HSV-1編碼的作用因子。然后通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該作用因子對(duì)hsa-miR-101-2及其宿主基因表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步確定該作用因子對(duì) hsa-miR-101-2的具體調(diào)控方式。最后通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)確定作用因子是否作為轉(zhuǎn)錄因子與hsa-miR-1

5、01-2啟動(dòng)子發(fā)生直接或間接的相互作用。
　　2.首先通過病毒滴定，免疫熒光，western blot等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定miR-101的直接靶基因COX2和GRSF1對(duì)HSV-1復(fù)制的具體作用。然后通過qRT-PCR確定COX2對(duì)干擾素表達(dá)水平的影響；并通過western blot，RNA免疫共沉淀及凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)確定GRSF1促進(jìn)HSV-1衣殼蛋白表達(dá)的具體作用方式，最終確定COX2和GRSF1影響HSV-1復(fù)制的具體分子途徑。

6、
　　【結(jié)果】：
　　1.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSV-1感染后，hsa-miR-101-2啟動(dòng)子活性顯著增強(qiáng)；
　　2.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá) HSV-1即刻早期蛋白 ICP4可以促進(jìn)hsa-miR-101-2啟動(dòng)子活性，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)ICP4可以促進(jìn)hsa-miR-101-2及其宿主基因的表達(dá)；
　　3.染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)及凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果

7、表明 ICP4可以直接結(jié)合hsa-miR-101-2啟動(dòng)子序列；
　　4.病毒滴定實(shí)驗(yàn)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 GRSF1可以促進(jìn)HSV-1復(fù)制，而COX2可以抑制HSV-1復(fù)制；
　　5. qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明COX2可以促進(jìn)I/III型干擾素的表達(dá)；
　　6. Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GRSF1可以促進(jìn)HSV-1衣殼蛋白p40的表達(dá)水平；
　　7. RNA免疫共沉

8、淀實(shí)驗(yàn)及RNA凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GRSF1可以與p40的mRNA直接結(jié)合。
　　【結(jié)論】：通過對(duì)本課題的深入研究，具體可以得到以下3個(gè)結(jié)論：
　　1、HSV-1通過其即刻早期蛋白ICP4誘導(dǎo)hsa-miR-101-2的表達(dá)升高，ICP4可以直接結(jié)合hsa-miR-101-2啟動(dòng)子序列并作為轉(zhuǎn)錄因子激活其轉(zhuǎn)錄活性。
　　2、miR-101的直接靶基因 COX2可以通過促進(jìn) I/III型干擾素的表達(dá)從而抑制HSV-1