白紋伊蚊miR-252對(duì)登革病毒E蛋白表達(dá)及登革病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景:登革病毒(dengue virus，DENV)是地理分布最廣的蟲(chóng)媒黃病毒，按抗原性可分為DENV-1～DENV-4四個(gè)血清型，同一血清型內(nèi)又可分成不同的基因型。登革病毒的基因組為單股正鏈RNA分子，具有感染性，分子量為3，800 kDa，約含11，000個(gè)堿基。在病毒基因組5'-UTR和3'-UTR之間為病毒的單一開(kāi)放讀碼框架(open reading frame，ORF)，編碼一個(gè)約含3400個(gè)氨基酸殘基的、分子量約380kDa

2、的聚蛋白分子。人感染登革病毒后根據(jù)臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度，分為登革熱(dengue fever, DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)、登革休克綜合征(the dengue shock syndrome， DSS)。可傳播登革病毒的蚊種主要為埃及伊蚊(Aedes aegypti，Ae.aegypti)和白紋伊蚊(Aedes albopictus，Ae.albopictus)。白紋伊蚊主要分布在亞洲熱帶

3、、亞熱帶和部分溫帶地區(qū)，現(xiàn)已傳播到北美、南美、歐洲和非洲大陸，對(duì)DENV-1～DENV-4均高度易感，在我國(guó)為登革的主要傳播媒介。隨著全球氣候變暖、生態(tài)環(huán)境的惡化、蟲(chóng)媒分布區(qū)域的擴(kuò)展，登革的流行范圍和頻率不斷增加。近十年來(lái)，登革熱在全世界的發(fā)病率提高了將近30倍，目前已波及全球100余個(gè)國(guó)家和地區(qū)，主要流行于非洲、南美洲、東南亞和西太平洋地區(qū)。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，除海南、福建、浙江和江蘇省有登革熱爆發(fā)外，我國(guó)的登革熱主要在廣東省流行

4、，已成為流行區(qū)域面臨的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為～22核苷酸(nucleotide，nt)的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與調(diào)控發(fā)育、細(xì)胞增值與分化、細(xì)胞凋亡、脂類代謝、激素分泌、機(jī)體免疫以及腫瘤發(fā)生、病毒感染等生理及病理過(guò)程。動(dòng)物細(xì)胞中絕大部分miRNA由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成miRNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(primary miRNA，

5、pri-miRNA)，在Pasha/DGR8的協(xié)同下，核酸酶Drosha將pri-miRNA切割成miRNA前體(precursor miRNA，pre-miRNA)。pre-miRNA由Exportin-5蛋白從細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)中，然后經(jīng)胞質(zhì)內(nèi)核酸酶Dicer的切割而加工成～22nt的miRNA:miRNA*雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)中的miRNA*通常迅速被降解;另一條5'端穩(wěn)定性較低的鏈即成熟的miRNA(mature miRNA

6、)則與Argonaute(Ago)蛋白家族成員結(jié)合進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplex，RISC)。miRNA引導(dǎo)RISC結(jié)合靶mRNA后在胞漿中積聚于P小體(P body)內(nèi)，miRNA可能在P小體中行使其基因沉默功能。經(jīng)典的理論認(rèn)為，miRNA能抑制基因的表達(dá)，miRNA利用其5'端2～8個(gè)堿基的“種子”序列(seedsequence)識(shí)別靶基因mRNA3'-UTR的互補(bǔ)序列，引起靶基

7、因mRNA的降解或者是翻譯抑制。但目前有研究發(fā)現(xiàn)miRNA的靶序列也可位于靶基因的5'-UTR區(qū)和編碼區(qū)中，miRNA亦可增強(qiáng)基因的表達(dá)。
　　 近年的研究提示病毒與宿主在miRNA水平存在相互的調(diào)節(jié)作用。一方面病毒自身可編碼miRNA，利用其促進(jìn)病毒自身復(fù)制與潛伏并抑制宿主細(xì)胞抗病毒活性;另一方面宿主細(xì)胞編碼的大量miRNAs，在調(diào)控自身基因表達(dá)的同時(shí)，可調(diào)控入侵病毒的復(fù)制。Lecellier等發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的miR-32可

8、抑制Ⅰ型泡沫病毒(primate foamy virus type1，PFV-1)的復(fù)制。Pedersen研究者通過(guò)序列互補(bǔ)分析發(fā)現(xiàn)5種受IFN-B調(diào)節(jié)的miRNA對(duì)HCV復(fù)制有明顯抑制作用;細(xì)胞轉(zhuǎn)染人工合成的miRNA類似物(miRNA mimic)混合物能使HCV mRNA水平顯著下降，而轉(zhuǎn)染相應(yīng)的反義miRNA抑制劑(miRNA inhibitor)能降低IFN-B的抗病毒作用。Triboulet等人發(fā)現(xiàn)敲除Dicer或Drosh

9、a可明顯增強(qiáng)Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV-1)感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclear cell，PBMC)中病毒的復(fù)制，提示細(xì)胞miRNA對(duì)HIV-1的復(fù)制具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。Hariharan等研究發(fā)現(xiàn)5種人miRNA在HIV基因組中能找到靶標(biāo)序列，miR-29a和miR-29b靶向nef基因，miR-149靶向vpr基因，miR-378靶向en

10、v基因，miR-324-5P靶向vif基因;這些靶序列在所有HIV病毒包膜序列中高度保守，提示細(xì)胞miRNA水平可能與HIV-1感染及病程相關(guān)。Yeung等應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)研究HIV感染的人T細(xì)胞中miRNA表達(dá)的變化，上述提到的5種miRNA水平顯著下調(diào)，提示細(xì)胞miRNA在HIV病毒-宿主相互作用中起重要作用。宿主miRNA也可被病毒利用促進(jìn)其維持潛伏或增進(jìn)復(fù)制。Jopling和Roberts等發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞特異性豐富表達(dá)的miR

11、-122可與HCV基因組5' UTR區(qū)的兩個(gè)互補(bǔ)序列相互作用，增強(qiáng)HCV在肝細(xì)胞中的復(fù)制。宿主細(xì)胞的miR-342-5p和miR-10a(miR-10a*)可分別靶向柯薩奇病毒B組(Group B coxsackieviruses，CVB)的2C編碼區(qū)和3D編碼區(qū)，抑制或增強(qiáng)CVB的復(fù)制，提示宿主細(xì)胞miRNA可識(shí)別CVB靶基因編碼區(qū)的互補(bǔ)序列，并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控病毒基因的表達(dá)，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制和增殖。
　　 蚊是非常重要的蟲(chóng)

12、媒病毒傳播媒介，目前僅有岡比亞按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊、致倦庫(kù)蚊以及白紋伊蚊鑒定出miRNAs。Winter等利用鳥(niǎo)槍克隆及生物信息學(xué)分析第一次證實(shí)了岡比亞按蚊18個(gè)miRNAs的存在。Mead等發(fā)現(xiàn)和鑒定了斯氏按蚊中的23個(gè)保守miRNAs和及4個(gè)新miRNAs。Li等發(fā)現(xiàn)了86個(gè)埃及伊蚊miRNA。Skalsky等采用高通量深度測(cè)序的方法從白紋伊蚊的C7/10細(xì)胞中鑒定出65個(gè)miRNA，從庫(kù)蚊中鑒定出77個(gè)miRNAs。對(duì)蚊蟲(chóng)mi

13、RNAs的功能了解得非常有限，有研究表明病原體入侵可影響蚊miRNAs表達(dá)水平。Winter等發(fā)現(xiàn)岡比亞按蚊miR-34在瘧原蟲(chóng)感染后表達(dá)量上調(diào)5倍，而miR-12和miR-281表達(dá)量下降3倍，敲除Dicer1和Ago1 mRNA后的岡比亞按蚊對(duì)瘧原蟲(chóng)的易感性升高，提示瘧原蟲(chóng)的感染可能與岡比亞按蚊miRNA的表達(dá)差異相關(guān)，miRNAs可能參與岡比亞按蚊抗瘧原蟲(chóng)感染。Osei-Amo等發(fā)現(xiàn)Wolbachia病毒感染前后的埃及伊蚊細(xì)胞內(nèi)的

14、miR-12呈現(xiàn)表達(dá)差異，提示miR-12可能和病毒的感染相關(guān)。Sckaly等用西尼羅病毒感染白紋伊蚊C7/10細(xì)胞，miR-989和miR-92表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，同樣條件下感染庫(kù)蚊，發(fā)現(xiàn)miR-989表達(dá)水平下調(diào)，而miR-92表達(dá)上調(diào);提示蚊miRNAs表達(dá)差異可能與病毒感染有關(guān)。最近的研究證實(shí)埃及伊蚊的miR-375可通過(guò)抑制NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的活性而增強(qiáng)DENV-2的感染。
　　 本課題組吳錦雅博士、鄭培民碩士運(yùn)用so

15、lex測(cè)序和Northern blot的方法在白紋伊蚊成蚊中檢測(cè)到miRNAs，并檢測(cè)到雌蚊經(jīng)胸腔注射登革病毒后，蚊體內(nèi)大量miRNAs出現(xiàn)表達(dá)差異，提示miRNAs可能在白紋伊蚊抗登革病毒感染中起調(diào)控作用。
　　 目的:我們?cè)诎准y伊蚊C6/36細(xì)胞中建立登革病毒蚊體外感染模型，期待通過(guò)了解登革病毒感染前后C6/36細(xì)胞中miRNAs表達(dá)水平的變化，挑選在C6/36細(xì)胞中表達(dá)量豐富并且在登革病毒感染前后變化幅度較高的miRNAs

16、，預(yù)測(cè)其在登革病毒基因組中可能的靶標(biāo)基因;測(cè)定miRNAs表達(dá)水平的變化對(duì)靶基因表達(dá)水平的影響，初步探討蚊細(xì)胞內(nèi)miRNA對(duì)登革病毒感染的調(diào)控作用，為登革病毒的防治提供一個(gè)新的思路。
　　 方法:建立白紋伊蚊C6/36細(xì)胞DENV-2感染模型，使用實(shí)時(shí)定量PCR(real timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)測(cè)定DENV-2感染前后C6/36細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表

17、達(dá)差異。使用RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)3種我們感興趣的miRNAs在DENV-2基因組中的靶標(biāo)，選擇在C6/36細(xì)胞中表達(dá)水平較高并在DENV-2感染前后表達(dá)量變化明顯的miR-252，通過(guò)RT-qPCR/western blot測(cè)定C6/36細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-252人工合成的類似物(mimic)或者反義抑制物(inhibitor)后，其預(yù)測(cè)的靶基因—登革病毒包膜蛋白(envelop protein，E protein)RNA/蛋白表達(dá)

18、水平的變化，了解miR-252在抗登革病毒感染中的作用。
　　 結(jié)果:白紋伊蚊C6/36細(xì)胞感染DENV-2后，細(xì)胞內(nèi)miR-252表達(dá)水平增高。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，在感染后24小時(shí)(hour，hr)，miR-252表達(dá)水平增高3.2倍(t=-9.850，P=0.010)，在感染后72 hrs，miR-252表達(dá)水平增高2.1倍（t=-6.751，P=0.021）。在DENV-2感染的白紋伊蚊C6/36細(xì)胞細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mi

19、R-252 mimic，增強(qiáng)miR-252的表達(dá)(24 hrs，t=-89.337，P＜0.001;72hrs，t=-28.508，P=0.001)，可降低DENV-2 RNA的表達(dá)(72 hrs，t=24.319，P=0.002)，western blot顯示E蛋白的表達(dá)受到抑制;反之，在DENV-2感染的白紋伊蚊C6/36細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-252 inhibitor，降低細(xì)胞內(nèi)miR-252水平(24hrs，t=16.381，P=0

20、.004;72hrs，t=33.680，P=0.001)，可增強(qiáng)DENV-2 RNA的表達(dá)(72 hrs，t=-43.250，P=0.001)，并可使E蛋白表達(dá)量增高。轉(zhuǎn)染了miR-252inhibitor的C6/36 cells上清液中的DENV-2滴度明顯增高，與陰性對(duì)照相比較，P=0.034;與mock相比較，P=0.019。將包含有與miR-252種子序列互補(bǔ)的E蛋白跨膜區(qū)克隆入海腎熒光素酶報(bào)告載體中，經(jīng)方差分析檢驗(yàn)，與對(duì)照組比