登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)單抗中和作用與作用機(jī)制研究以及登革病毒初次感染患者血清中和抗體反應(yīng)分析.pdf

1、登革病毒(DENV)屬于病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavivirus)，通過伊蚊等蟲媒叮咬進(jìn)入人體。根據(jù)血清抗原性的不同分為四個(gè)血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，人類感染其中的任何一型，癥狀輕者表現(xiàn)為無癥狀感染或發(fā)熱，重者可出現(xiàn)嚴(yán)重威脅生命的登革出血熱(DHF)或登革休克綜合征(DSS)。登革熱主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，威脅著全世界2/5人口健康，但隨著國際交流日益頻繁、氣候變暖、城市

2、化進(jìn)程加速等原因，登革病毒的流行范圍也隨之?dāng)U大。WHO數(shù)據(jù)表明，2000年后平均每年報(bào)道的感染人數(shù)達(dá)1億，每50萬～100萬例DHF/DSS中約有2.2萬例患者死亡，主要為兒童。登革病毒已成為全球公共健康的威脅。
　　 盡管登革病毒的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過60年，但迄今為止，尚未研發(fā)出安全有效的登革疫苗或特異性治療藥物，主要原因在于對DHF/DSS的發(fā)病機(jī)制了解不足。DENV初次感染后體內(nèi)能產(chǎn)生對四型病毒均有中和活性的抗體，但這一交叉保護(hù)

3、作用僅能持續(xù)幾個(gè)月，隨后交叉反應(yīng)性抗體的中和活性下調(diào)。當(dāng)二次感染異型登革病毒時(shí)，這些交叉反應(yīng)性或亞中和活性抗體能促進(jìn)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞而獲得大量復(fù)制，這一現(xiàn)象稱為抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)效應(yīng)(ADE)，研究表明，ADE是DHF和DSS發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。
　　 登革病毒是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，呈二十面體結(jié)構(gòu)，病毒體的直徑大約為50 nm，基因組大小為10.7 kb，編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(structuralprotein)，分別

4、是衣殼蛋白（capsid，C）、前膜/膜蛋白(premembrane/membrane，prM/M)和包膜蛋白(envelope，E)，以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，分別是NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中，E蛋白是機(jī)能蛋白，它通過自身構(gòu)象的改變或表面單元的重排，參與病毒與細(xì)胞吸附、病毒進(jìn)入細(xì)胞、細(xì)胞膜融合以及病毒組裝等病毒生命周期的重要過程。E蛋白是暴露于病毒體表面主要成份，因此，宿主針對DENV產(chǎn)生的

5、中和抗體反應(yīng)也主要針對這一蛋白。該蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(ED)，分別EDⅠ，EDⅡ和EDⅢ，EDⅠ位于中央，呈β環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)象改變參與病毒進(jìn)入靶細(xì)胞和核衣殼的脫殼;EDⅡ位于側(cè)部，含有在黃病毒屬中高度保守的融合環(huán)，參與細(xì)胞膜融合;EDⅢ呈免疫球蛋白樣折疊，被普遍認(rèn)為含有與靶細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)。三者均可在宿主體內(nèi)誘發(fā)抗體反應(yīng)，但是研究表明，針對EDⅠ的抗體大多數(shù)是無中和活性的抗體;識(shí)別EDⅡ融合肽免疫顯性表位的抗體，在黃病

6、毒屬成員間存在廣泛的交叉反應(yīng)，但大多無相對應(yīng)的交叉中和活性;EDⅢ誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體中和活性最強(qiáng)，并且絕大部分為登革病毒特異性抗體。
　　 四型登革病毒之間E蛋白氨基酸序列同源性高達(dá)72％～80％，EDⅢ不僅存在血清型特異性中和表位，還存在登革病毒亞交叉或交叉反應(yīng)性中和表位，因此，以EDⅢ作為登革疫苗研制的靶標(biāo)可能產(chǎn)生同時(shí)針對四型登革病毒的中和抗體，具有廣譜抗病毒作用。由于目前尚無獲得批準(zhǔn)的登革疫苗或抗病毒藥物，對登革病毒和其他相關(guān)

7、蟲媒病毒的保護(hù)主要還是通過中和抗體介導(dǎo)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，EDⅢ中和抗體不管是被動(dòng)免疫或是治療性免疫均能獲得很好的保護(hù)效果。因此，若能獲得具有強(qiáng)中和活性的EDⅢ抗體，在病毒感染早期有效中和體內(nèi)登革病毒，對控制疾病加重具有重大意義。由此可見，不管是登革病毒EDⅢ蛋白還是EDⅢ中和抗體在抗病毒研究中具有重要地位，它們是E蛋白廣譜交叉抗原表位分析、新型登革疫苗和抗病毒藥物研究的重要工具。
　　 明確中和抗體與病毒的相互作用對登革病毒致病和

8、免疫機(jī)制的闡明至關(guān)重要。目前所獲得的中和抗體的抗病毒特征絕大部分都來源于鼠源性單抗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)表明中和活性最強(qiáng)的抗體主要針對EDⅢ抗原表位，對其表位特征亦已清晰闡明，識(shí)別位點(diǎn)主要位于EDⅢ的側(cè)脊和A鏈區(qū)。盡管有研究發(fā)現(xiàn)登革熱患者血清EDⅢ抗體與中和活性存在關(guān)聯(lián)性，但近年來一些研究也發(fā)現(xiàn)EDⅢ抗體僅占抗病毒免疫血清中很小一部分，絕大部分為交叉反應(yīng)性抗體，去除血清中EDⅢ抗體成份并未對血清的中和活性產(chǎn)生影響，推斷中和抗體識(shí)別表位可能

9、位于EDⅢ以外部分。因此，EDⅢ抗體在天然抗病毒免疫中作用存在爭議，明確登革病毒患者血清中和抗體反應(yīng)的特點(diǎn)以及EDⅢ抗體對中和活性的作用，對于抗病毒的研究意義重大，也需要更多的臨床數(shù)據(jù)支撐。
　　 本研究分為以下兩個(gè)部分內(nèi)容:
　　 第一部分:登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)單抗的體內(nèi)外中和作用及其作用機(jī)制的初步研究
　　 登革病毒包膜E蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域（EDⅠ，EDⅡ和EDⅢ）

10、。研究認(rèn)為EDⅢ是參與病毒與宿主細(xì)胞吸附的區(qū)域，同時(shí)EDⅢ誘發(fā)的特異抗體的體內(nèi)外中和活性最強(qiáng)。因此，EDⅢ在登革病毒致病機(jī)制和抗病毒研究方面意義重大，已成為登革DNA或蛋白疫苗研制的重要靶標(biāo)。本研究中，設(shè)想構(gòu)建對四型登革病毒具有廣譜中和活性的EDⅢ反應(yīng)單抗。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，以重組DENV1～4 EDⅢ單獨(dú)或混合免疫小鼠制備了一批EDⅢ反應(yīng)性單抗，通過間接酶聯(lián)免疫吸咐實(shí)驗(yàn)（ELISA）和免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)測定它們對四型登革病毒的

11、反應(yīng)特性，發(fā)現(xiàn)一株單抗能同時(shí)與四型病毒相結(jié)合，表明它是一株登革病毒群叉反應(yīng)性單抗，命名為2D73。為了觀察單抗2D73對四型病毒是否也具有交叉中和活性，采用本實(shí)驗(yàn)室建立的基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的微中和實(shí)驗(yàn)方法（ELISPOT-MNT），測定單抗對四型登革病毒的體外中和活性，結(jié)果顯示單抗2D73對四型病毒均具有較強(qiáng)的中和活性，其50％抑制濃度（IC50）分別為0.28、0.16、0.18和18.82μg/ml。以用1日齡昆明乳鼠作為登革病毒

12、感染模型進(jìn)行抗體體內(nèi)保護(hù)性效果評價(jià)，隨著抗體濃度的增加，乳鼠發(fā)病時(shí)間延遲、存活率顯著提高，呈明顯的濃度依賴關(guān)系，對四型登革病毒表現(xiàn)出與體外中和活性相平行的體內(nèi)保護(hù)作用。由于目前普遍認(rèn)為病毒與靶細(xì)胞結(jié)合的位點(diǎn)位于EDⅢ，因此EDⅢ抗體可能在抑制病毒與細(xì)胞吸咐方面具有重要作用。為進(jìn)一步揭示2D73中和作用的機(jī)制，我們采用前后吸咐試驗(yàn)檢測抗體在阻斷病毒與細(xì)胞吸咐的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體在前吸咐實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行б种撇《靖腥炯?xì)胞，而在后吸咐試驗(yàn)中抗體抑制感

13、染效果明顯降低，表明其中和作用主要通過抑制病毒與細(xì)胞表面受體的吸咐而有效阻斷了病毒進(jìn)入細(xì)胞。對重組EDⅢ蛋白與2D73抗體Fab段的晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，單抗2D73所識(shí)別表位在四型登革病毒中高度保守（見另一博士論文）。上述結(jié)果提示，包括2D73在內(nèi)的對DENV1～4中和活性強(qiáng)的抗體，它們所識(shí)別的高度保守性抗原表位有可能成為今后疫苗研制的重要靶標(biāo)。
　　 第二部分:Ⅰ型登革病毒初次感染患者恢復(fù)期血清中和抗體效價(jià)與EDⅢ抗體滴度相關(guān)性

14、分析
　　 明確登革病毒感染患者中和抗體的反應(yīng)特點(diǎn)，對于登革疫苗有效性評估、登革熱流行病學(xué)調(diào)查和感染診斷具有重要作用。目前對登革病毒中和抗體的研究大部分都基于鼠源性抗體，為了揭示天然免疫狀況下登革病毒感染者的中和抗體反應(yīng)特異性，以及明確抗體中和活性與EDⅢ抗體水平的關(guān)系，在本研究中，收集了30例明確診斷為Ⅰ型登革病毒初次感染的患者恢復(fù)期血清，利用ELISPOT-MNT測定每例血清對四型登革病毒的中和抗體效價(jià)。并建立一種特異、可靠

15、的雙抗原夾心ELISA法用于檢測血清中EDⅢ特異性抗體的效價(jià)，該方法以酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組EDⅢ蛋白作為抗原，捕獲血清中的特異性EDⅢ抗體，分析血清對DENV-1的中和效價(jià)與同型特異性EDⅢ抗體效價(jià)的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，這些患者的恢復(fù)期血清對DENV-1中和活性最強(qiáng)，而對其他三型病毒的中和活性遠(yuǎn)不如前者。這一結(jié)果提示，與登革病毒感染初期體內(nèi)的抗體反應(yīng)不同，隨時(shí)間推移，體內(nèi)針對其他血型的中和抗體中和活性下降，而同型特異性中和抗體的中和

16、活性上升，成為最具優(yōu)勢的中和抗體。30例血清的EDⅢ抗體效價(jià)高低差異大，高者達(dá)到1∶80，低者可低于臨界值，對DENV-1的中和效價(jià)與血清型特異EDⅢ抗體效價(jià)的相關(guān)性進(jìn)分析，發(fā)現(xiàn)兩者不存在相關(guān)性(R=0.194，P=0.305)，這一發(fā)現(xiàn)與目前認(rèn)為的型特異性EDⅢ抗體并非介導(dǎo)同型登革病毒中和的主要抗體的理論相一致。
　　 小結(jié):
　　 綜上所述，本研究取得以下成果:
　　 一、獲得了一株對四型登革病毒交叉反應(yīng)的E

17、DⅢ鼠源性單抗，該抗體對四型登革病毒均有較強(qiáng)的體外中和活性，并具有與體外中和活性相平行的體內(nèi)保護(hù)作用。它通過阻斷病毒與細(xì)胞表面受體的吸咐而發(fā)揮中和作用。這一抗體可以進(jìn)一步用于E蛋白廣譜交叉抗原表位分析和抗登革病毒的治療。并為新型登革疫苗的研制提供新的思路。
　　 二、建立了一種用于檢測登革病毒感染患者體內(nèi)EDⅢ抗體雙抗原夾心ELISA法，由于該方法采用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EDⅢ重組蛋白，蛋白具有更好折疊性，更接近于天然構(gòu)象。因此，以

18、DENV-1 EDⅢ重組蛋白作為包被抗原，以標(biāo)記了HRP的DENV-1 EDⅢ重組蛋白作為檢測抗原，測定患者血清中的特異性EDⅢ抗體，具有更高的特異性、更好的可靠性。
　　 三、用快速高通量的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微中和實(shí)驗(yàn)方法測定30例Ⅰ型登革病毒初次感染患者三年后恢復(fù)期血清對四型登革病毒的中和效價(jià)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)血清對同型病毒的中和效價(jià)最高，遠(yuǎn)高于對異型病毒的中和效價(jià)，證實(shí)了登革病毒初次感染可產(chǎn)生終生有效的同型中和抗體。但血清的對Ⅰ型登