蜱傳腦炎病毒中和抗體研究.pdf

1、蜱傳腦炎（tick-borne encephalitis，TBE）又名森林腦炎，是經(jīng)硬蜱媒介傳播的自然疫源性傳染病，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病原體是蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus,TBEV）。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有超過(guò)10000例蜱傳腦炎感染患者；在我國(guó)，蜱傳腦炎已被列為5大職業(yè)性傳染病之一。近年來(lái)隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展、旅游業(yè)爆發(fā)式增長(zhǎng)，遠(yuǎn)足、探險(xiǎn)等戶外活動(dòng)興起，進(jìn)入森林疫區(qū)人群數(shù)量呈現(xiàn)逐

2、年上升趨勢(shì)，蜱傳腦炎的發(fā)病率也在逐年升高，威脅著廣大人民群眾的生命健康。此外，蜱傳腦炎病毒還是重要的生物戰(zhàn)劑之一，美國(guó)CDC將其列為病毒C類生物武器。蜱傳腦炎致殘率高，臨床上尚無(wú)特異性療法，主要采用支持治療和一般對(duì)癥治療為主。疫苗接種是預(yù)防蜱傳腦炎的主要手段之一。
　　當(dāng)前，大部分蜱傳腦炎病毒抗體多是研究用的鼠源性單抗，尚未有全人源TBEV單抗報(bào)道。在本研究中，我們擬通過(guò)流式分選-單細(xì)胞PCR技術(shù)，從蜱傳腦炎疫苗免疫志愿者體內(nèi)篩選

3、獲得全人源中和單克隆抗體，為蜱傳腦炎治療和預(yù)防提供新的途徑。
　　實(shí)驗(yàn)選取2名健康男性志愿者（25-40歲），在告知并簽署知情同意書后按照蜱傳腦炎滅活疫苗（長(zhǎng)春生物制品研究所有限公司研制）說(shuō)明書要求，分別在第0天、14天對(duì)志愿者進(jìn)行2次免疫，又在第42天加強(qiáng)免疫1次。采集志愿者第0天、21天、28天、49天和63天血液樣本，ELISA檢測(cè)血清抗體滴度，結(jié)果表明兩名志愿者均產(chǎn)生了針對(duì)TBEV的特異抗體。用Ficoll-hypaque

4、法分離志愿者第49天血液樣本20 mL，獲得的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）經(jīng)熒光抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞分選儀分選出CD19+/CD3-/CD20-/CD27high/CD38high特異的單個(gè)抗體分泌細(xì)胞。
　　我們先后共計(jì)分選獲得1632個(gè)單細(xì)胞克隆，占上樣細(xì)胞總數(shù)的0.02％；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，擴(kuò)增出重、輕鏈配對(duì)克隆349個(gè)，配對(duì)克隆的

5、擴(kuò)增效率約21.38%；對(duì)巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和IMGT/V-QUEST分析，最終獲得有用克隆175個(gè)。對(duì)175個(gè)單克隆巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)一步擴(kuò)增抗體基因可變（V）區(qū)，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)與抗體啟動(dòng)子-前導(dǎo)序列和恒定區(qū)-多聚A尾序列連接，構(gòu)建出抗體基因重、輕鏈線性表達(dá)框。將抗體線性表達(dá)框基因轉(zhuǎn)染到Expi293F細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)后，ELISA方法篩選到14株具有結(jié)合活性的單克隆抗體。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了這14株結(jié)合單抗在BHK-21細(xì)胞中對(duì)T

6、BEV活病毒的中和效果，發(fā)現(xiàn)兩株具有一定中和保護(hù)能力的單抗1C4和3E12。在抗體濃度達(dá)到200μg/mL以上時(shí)，1C4和3E12兩株單抗對(duì)細(xì)胞能夠起到完全保護(hù)效果，其中1C4的保護(hù)效果要強(qiáng)于3E12，1C4的IC50值為75μg/mL，而3E12的IC50值為108μg/mL。
　　為對(duì)篩選到的抗體作進(jìn)一步研究，我們?cè)谠讼到y(tǒng)表達(dá)純化了TBEV抗原E和NS1蛋白。TBEV在病毒分類學(xué)上屬黃病毒科（Flavivirade）黃病毒屬

7、（Flavivirus），為單股正鏈RNA包膜病毒。其抗原成分包括結(jié)構(gòu)蛋白E和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。我們將TBEV抗原E和NS1基因克隆到pET-32a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化，兩個(gè)蛋白均以包涵體形式表達(dá)。NS1蛋白純化過(guò)程以尿素為變性劑，將包涵體溶解后過(guò)鎳柱純化，然后通過(guò)逐步減少尿素濃度進(jìn)行透析復(fù)性，最后獲得純化的NS1蛋白；E蛋白用相同方法進(jìn)行純化時(shí)，在復(fù)性過(guò)程中總是會(huì)變成沉淀析出，于是我們嘗試采用比較溫和的

8、變性劑—十二烷基肌氨酸鈉溶解包涵體，然后在含氧化還原體系（GSH和GSSG）的TE緩沖液中進(jìn)行透析復(fù)性，最后獲得E抗原蛋白。
　　我們將純化好的NS1蛋白和E蛋白與志愿者陽(yáng)性血清分別進(jìn)行Western Blot和ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性血清只與E蛋白反應(yīng)而不與NS1蛋白起作用，說(shuō)明本研究中使用的滅活疫苗有效成分包含抗原E蛋白，而不包含NS1蛋白。將E抗原蛋白包被后與中和單抗1C4、3E12進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，結(jié)果表明具有中和活性的

9、1C4和3E12兩株單抗與原核表達(dá)的E抗原蛋白具有較弱的結(jié)合活性，這可能是因?yàn)閮芍陠慰贡旧碛H和力較低。
　　考慮到原核表達(dá)的抗原蛋白缺乏糖基化修飾；此外，蜱傳腦炎病毒膜蛋白prM在病毒復(fù)制成熟過(guò)程中也起重要作用，所以我們又分別將抗原prM-E和NS1基因克隆到真核表達(dá)載體pDC316，并在293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。用志愿者陽(yáng)性血清對(duì)293T細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western Blot鑒定，可觀察到prM-E蛋白在55 kDa處出現(xiàn)特異性

10、條帶，說(shuō)明prM-E基因得到表達(dá)并能與陽(yáng)性血清反應(yīng)；而NS1蛋白無(wú)目的條帶，考慮是因?yàn)镹S1蛋白不是滅活疫苗的有效抗原成分，志愿者血清中缺乏抗NS1抗體所致。在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)prM-E抗原在真核表達(dá)的細(xì)胞裂解物沉淀，在與篩選到的中和單抗單獨(dú)反應(yīng)時(shí)均難以出現(xiàn)明顯目的條帶；而將兩株單抗混合在一起時(shí)，則可以看到明顯特異條帶。這說(shuō)明我們篩到的兩株中和單抗可能分別結(jié)合于抗原E蛋白的不同表位，盡管單獨(dú)使用時(shí)抗原抗體相互作用

11、比較弱，但混合在一起仍可看出明顯特異條帶。
　　綜上所述，本研究基于流式分選-單細(xì)胞PCR技術(shù)成功從蜱傳腦炎滅活疫苗免疫志愿者體內(nèi)篩選獲得2株具有中和活性的單克隆抗體，該抗體可進(jìn)一步研究用作潛在的治療蜱傳腦炎感染的被動(dòng)免疫制劑；通過(guò)原核和真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了TBEV抗原蛋白E和NS1，其中只有E抗原能與志愿者陽(yáng)性血清有結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明滅活疫苗的有效成分包含抗原E蛋白；此外，篩選到的中和單抗與抗原E蛋白具有結(jié)合活性，說(shuō)明兩株中和單抗的靶