IKK-β通過p85 S6K1調(diào)節(jié)過氧化氫誘導(dǎo)的細胞死亡.pdf

1、一、研究背景:
　　 細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)對于細胞的存活及功能至關(guān)重要。參與細胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)是細胞內(nèi)主要的氧化劑(oxidants)。正常生理低水平ROS可作為第二信使分子，傳遞胞內(nèi)細胞信號并參與細胞的各種生理活動如細胞代謝、增殖、分化與凋亡等。然而過多的ROS可損傷核酸、脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。較高水平或持續(xù)存在的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可導(dǎo)致細

2、胞內(nèi)大分子的氧化修飾，或通過激活特定的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致細胞損傷及異常死亡。ROS引起的細胞損傷與異常細胞死亡參與了多種人類重大疾病如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病及衰老等的病理發(fā)生與進展過程，闡明ROS引起異常細胞死亡及相關(guān)疾病的發(fā)病機制對探索這些疾病新的防治方法具有重要意義。
　　 核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)信號通路在調(diào)節(jié)細胞存活及死亡過程中起重要作用。NF-κB是一種廣泛存在

3、于真核細胞內(nèi)的基因多向性轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel家族。在哺乳動物細胞中存在5種NF-κB成員，它們之間形成不同的同源或異源二聚體復(fù)合物。在大部分細胞中NF-κB復(fù)合物存在于胞質(zhì)中，其活性受Iκ-Bs(inhibitorsofNF-κB)蛋白家族抑制。作為NF-κB的上游分子，IKK的活化是激活NF-κB經(jīng)典途徑的關(guān)鍵步驟。IKK包括三個亞單位:IKK-α(IKK1)、IKK-β(IKK2)和IKK-γ(NEMO)。IKK-α和IKK-β是催

4、化亞單位，IKK-γ是調(diào)節(jié)亞單位。目前已發(fā)現(xiàn)一些NF-κB和Iκ-B非依賴的IKK作用底物，因此IKK的激活可能介導(dǎo)了更廣泛的信號通路，調(diào)控細胞更多的生物學(xué)進程。IKK/NF-κB通路活化后能夠促進炎癥的發(fā)生，細胞增殖以及抵抗凋亡，但最近也有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號可促進細胞死亡。IKK在氧化應(yīng)激中是否有促進細胞死亡的作用尚未有研究，IKK/NF-κB促進細胞死亡的分子機制仍不清楚。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalia

5、ntargetofrapamycin，mTOR)是一種進化上高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬肌醇3-磷酸激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3-K)蛋白激酶家族，是細胞代謝、生長增殖、存活與應(yīng)激等生理過程的調(diào)節(jié)中心。mTOR在細胞內(nèi)通過與其他多種蛋白形成兩種不同的復(fù)合物(mTORC1與mTORC2)而發(fā)揮功能，雷帕霉素可特異性地抑制mTORC1。我們以往的研究表明ROS可時間、劑量與細胞依賴性地調(diào)節(jié)mT

6、ORC1信號通路，但ROS調(diào)節(jié)mTORC1信號通路的分子機制還不清楚。
　　 S6K1是mTORC1的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在調(diào)節(jié)細胞生長、代謝、存活、腫瘤進展與衰老中起重要作用。S6K1有兩種亞型，是由同一個轉(zhuǎn)錄子(mRNA)通過選擇不同的翻譯起始位點而得到的不同產(chǎn)物。p70S6K1，主要分布于細胞質(zhì)中;p85S6K1N-端較p70S6K1多了一段由23個氨基酸殘基構(gòu)成的核定位信號(nuclearlocalizationsignal，

7、NLS)，被認為主要分布于細胞核內(nèi)。mTORC1磷酸化p70S6K1Thr389位點或相應(yīng)的p85S6K1Thr412位點是其活化的關(guān)鍵步驟。由于早期研究發(fā)現(xiàn)p70與p85可一致性地受生長因子與營養(yǎng)調(diào)節(jié)并發(fā)揮功能，多數(shù)研究集中在p70S6K1，對p85S6K1的調(diào)節(jié)與功能則知之甚少。
　　 mTORC1/S6K1一般被認為是促進細胞存活的，但最近研究也發(fā)現(xiàn)mTORC1/S6K信號可促進阿霉素或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細胞死亡。而且，IK

8、K信號與mTORC1信號之間存在相互調(diào)節(jié)。本研究旨在闡明IKK、mTORC1/S6K1在ROS引起細胞死亡中的作用并探討其分子機制，為ROS引起細胞異常死亡及相關(guān)疾病發(fā)生的機制提供新的內(nèi)容，為氧化應(yīng)激引起相關(guān)疾病的防治提供新的靶點。
　　 二、研究結(jié)果:
　　 1.IKK-β通過NF-κB非依賴途徑介導(dǎo)H2O2引起的細胞死亡
　　 首先，采用siRNA敲低IKK-β的蛋白表達水平，能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的乳腺癌

9、MCF-7細胞死亡:對照組(negativecontrol，NC)細胞的死亡率為83.2％，而IKK-βsiRNA干擾組死亡率為35.3％(P＜0.05)，但敲低IKK-α卻沒有類似的保護作用，其細胞死亡率與NC組類似(P＞0.05)。其次，使用IKK特異性抑制劑預(yù)處理MCF-7細胞，同樣能顯著緩解H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡(P＜0.05)。再者，在MCF-7細胞中過表達HA-IKK-β能使細胞對H2O2誘導(dǎo)的死亡更敏感，而過表達HA-IK

10、K-α卻沒有類似的現(xiàn)象。IKK-βsiRNA下調(diào)IKK-β表達并顯著抑制H2O2引起的細胞死亡的結(jié)果在Hela、HCT116細胞中也得到驗證(P＜0.05)。這些結(jié)果提示，IKK-β而不是IKK-α在H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡中起關(guān)鍵作用。
　　 我們進一步探討氧化應(yīng)激中IKK-β促進的細胞死亡是否由其經(jīng)典下游信號NF-κB介導(dǎo)。蛋白酶體抑制劑MG132可以通過抑制其抑制分子IκB-α的蛋白酶解從而阻止NF-κB的轉(zhuǎn)位和激活，然而M

11、G132并不能阻止H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡。再者，利用p65siRNA敲低MCF-7細胞內(nèi)p65蛋白水平同樣未能降低H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡(P＞0.05)。這些研究表明，IKK-β可通過NF-κB非依賴途徑介導(dǎo)H2O2引起的細胞死亡。
　　 2.p85S6K1而不是p70S6K1以雷帕霉素非依賴途徑介導(dǎo)H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡
　　 我們進一步探討IKK-β介導(dǎo)H2O2引起細胞死亡的機制。最近有報道發(fā)現(xiàn)IKK信號通路與mTO

12、RC1通路之間有相互調(diào)節(jié)。為研究mTORC1/S6K1在ROS引起細胞死亡中的作用，我們首先采用mTORC1抑制劑雷帕霉素預(yù)處理細胞，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理不能阻止H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡，也不能抑制HA-IKK-β過表達引起的細胞死亡增加。接著，采用siRNA干擾mTOR或Raptor(mTORC1成員)的表達，同樣不能減少H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡。再者，敲低細胞中的Rheb(mTORC1上游活化因子)蛋白表達水平以抑制mTORC1信號，也不能

13、使細胞抵抗H2O2誘導(dǎo)的死亡(P＞0.05)。然而，采用siRNA敲低MCF-7細胞S6K1的水平能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡:NC組細胞的死亡率為83.2％而S6K1siRNA干擾組細胞死亡率為36.7％(P＜0.05)。由于S6K1siRNA能同時敲低p70與p85S6K1的蛋白表達水平，為研究p70與p85S6K1在這一過程中的作用，我們進一步在MCF-7細胞中分別過表達兩種蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達p85S6K1而不是p70S6K

14、1能顯著促進H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡(P＜0.05)。以上結(jié)果表明在H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡中，p70S6K1和p85S6K1具有不同的功能，p85S6K1而不是p70S6K1能夠以雷帕霉素不敏感、mTORC1非依賴途徑促進細胞死亡。
　　 3.H2O2通過雷帕霉素不敏感途徑激活p85S6K1而不激活p70S6K1
　　 為研究p70與p85S6K1的不同功能，我們檢測了H2O2對p70(T389)與p85(T412)S6K

15、1磷酸水平的影響。我們發(fā)現(xiàn)，在雷帕霉素存在的條件下，H2O2可時間與劑量依賴地引起p85S6K1(T412)磷酸化水平增加，也就是說H2O2引起的p85S6K1(T412)磷酸化是雷帕霉素非依賴的，但p70S6K1(T389)磷酸化水平卻沒有增強。同樣，以mTOR激酶活性抑制劑Pp242(同時抑制mTORC1/2)預(yù)處理細胞也不能阻止H2O2引起的p85S6K1(T412)磷酸化水平的增加。這些結(jié)果在MCF-7、Hela、HCT116等

16、多種細胞中得到進一步證實。相應(yīng)地，S6K1底物分子S6(S235/236)的磷酸化在這些條件下也被上調(diào)，且過表達p85而不是p70S6K1可促進H2O2引起的雷帕霉素非依賴的P-S6(S235/236)增加。體外激酶活性實驗進一步證實，p85S6K1而不是p70S6K1負責H2O2引起的雷帕霉素不敏感的S6(S235/236)磷酸化。
　　 因此，H2O2可以通過雷帕霉素不敏感、mTOR激酶活性非依賴的途徑激活p85S6K1而不

17、是p70S6K1。
　　 4.氧化應(yīng)激條件下IKK-β參與雷帕霉素非敏感的p85S6K1的活化
　　 由于IKK-β與p85S6K1均在H2O2引起細胞死亡中起重要作用，我們推測IKK-β可能參與了H2O2引起mTORC1非依賴的p85S6K1活化。我們發(fā)現(xiàn)H2O2能激活I(lǐng)KK信號通路，因為H2O2能增強IKK-α/β(S176/180)的磷酸化水平，同時促進IκB-α的降解，且具有時間依賴性。另外IKK的特異性抑制劑w

18、edelolactone，而不是PI-3K的抑制劑Ly294002能夠抑制在雷帕霉素存在下H2O2引起的p85S6K1(T412)和S6(S235/236)的激活。同時采用siRNA敲低IKK-β而不是IKK-α的表達能夠顯著抑制H2O2引起的雷帕霉素不敏感的p85S6K1(T412)和S6(S235/236)的磷酸化水平。因此，IKK-β參與了H2O2引起的mTORC1非依賴的p85S6K1活化。
　　 5.IKK-β與p85

19、S6K1而不與p70S6K1相互作用
　　 IKK-β在H2O2引起mTORC1非依賴的p85S6K1活化中起關(guān)鍵作用提示，IKK-β可能與p85S6K1相互作用并直接磷酸化p85S6K1。
　　 確實，免疫共沉淀試驗發(fā)現(xiàn)，外源表達的IKK-β的免疫沉淀物中可以同時檢測到p85S6K1的存在。這一結(jié)果在內(nèi)源性IKK-β的免疫共沉淀試驗中得到進一步確認。免疫熒光染色也顯示IKK-β與p85S6K1在胞質(zhì)中存在共定位。免疫熒

20、光染色與細胞組分分離(fractionation)也證實無論是外源表達還是內(nèi)源性p85S6K1與p70S6K1都主要分布在細胞質(zhì)中，細胞核也有少量表達。這些結(jié)果提示IKK-β與p85S6K1存在相互作用。我們進一步通過IKK-β的體外激酶實驗檢測IKK-β是否可直接磷酸化p85S6K1。令人遺憾的是，活化的IKK-β可在體外磷酸化其傳統(tǒng)底物GST-IκB-α(S32/36)，但不能磷酸化細菌表達并純化的his-p85S6K1及his-p

21、70S6K1。這些結(jié)果表明，可能存在其他未知激酶負責氧化應(yīng)激條件下mTORC1非依賴的p85S6K1磷酸化，但IKK-β在這一過程中也起關(guān)鍵作用，可能作為銜接蛋白募集其他激酶或負責磷酸化激活其他未知激酶。
　　 6.IKK-β通過激活p85S6K1-Mdm2-p53信號通路介導(dǎo)H2O2引起的細胞死亡
　　 我們進一步研究了IKK-β-p85S6K1在介導(dǎo)H2O2引起細胞死亡中的作用與分子機制。我們發(fā)現(xiàn)，采用siRNA下調(diào)

22、S6K1可以阻止氧化應(yīng)激中因IKK-β過表達促進的細胞死亡;過表達p85而不是p70S6K1可恢復(fù)IKK-β敲低引起的細胞死亡減少，這些研究證明p85而不是p70S6K1介導(dǎo)了氧化應(yīng)激中IKK-β促進細胞死亡的功能。
　　 最近一項研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中S6K1可與Mdm2相互作用并磷酸化其S163位點，進一步阻止其進入細胞核參與p53的泛素化降解，從而引起p53的累積與細胞死亡。
　　 我們檢測到H

23、2O2也可以促進Mdm2(S166)(human)的磷酸化，并且具有濃度依賴性，該位點相當于鼠的S163位點。盡管Mdm2的蛋白表達水平因雷帕霉素處理而略微減少，但H2O2仍能在雷帕霉素存在的情況下磷酸化Mdm2(S166)。再者，siRNA敲低IKK-β或S6K1可以抑制Mdm2(S166)的磷酸化。過表達IKK-β和p85S6K1可以增強Mdm2(S166)的磷酸化水平，但過表達p70S6K1卻不能使Mdm2(S166)磷酸化水平增

24、強。這些發(fā)現(xiàn)揭示，氧化應(yīng)激條件下IKK-β-p85S6K1能夠以雷帕霉素不敏感的方式磷酸化Mdm2(S166)。
　　 進一步研究發(fā)現(xiàn)H2O2處理MCF-7細胞可增加p53蛋白的水平，并且具有時間依賴性;但這種蛋白水平的增加可因IKK特異性抑制劑wedelolactone預(yù)處理細胞而受抑制。同樣的，siRNA敲低IKK-β或S6K1也能抑制H2O2誘導(dǎo)的p53積累。這些結(jié)果提示IKK-β和p85S6K1在H2O2誘導(dǎo)p53積累中

25、起重要作用。此外，siRNA敲低p53表達能顯著抑制H2O2引起的細胞死亡，并且采用siRNA同時敲低p53及S6K1或IKKβ水平同樣可阻止H2O2引起的細胞死亡，且其保護效果與單獨敲低p53、S6K1和IKKβ表達水平相當，提示p53介導(dǎo)了氧化應(yīng)激中IKK-β或p85S6K1促進的細胞死亡。
　　 因此，IKK-β可能通過激活p85S6K1-Mdm2-p53信號通路介導(dǎo)H2O2引起的細胞死亡。
　　 三、結(jié)論:

26、>　　 綜上所述，我們的研究揭示了一條新的涉及IKK-β、p85S6K1、Mdm2與p53氧化應(yīng)激反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。通過這條通路，ROS激活I(lǐng)KK-β進而以mTORC1非依賴的方式激活p85S6K1，活化的p85S6K1進一步磷酸化Mdm2(S166)從而上調(diào)p53，最終導(dǎo)致細胞的死亡。IKK-β促進細胞死亡的作用為IKK-β的功能及其調(diào)節(jié)機制增添了新的內(nèi)容，IKK-β是否能成為防治ROS引起異常細胞死亡相關(guān)疾病如癌癥的靶點，以及其抑