桑螟β-呋喃果糖苷酶基因的克隆與功能研究.pdf

1、植物會在昆蟲噬咬部位滲出大量乳汁或其他分泌物來抵抗蟲害。桑葉乳汁中含有大量1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)等生物堿對蓖麻蠶等非食桑昆蟲具有毒害致死作用。家蠶不受桑葉生物堿的毒害作用，其分子機制尚不明確。家蠶β-呋喃果糖苷酶(β－FFase)基因BmSuc1是首個報道的動物型該類中腸蔗糖水解酶基因，在家蠶抵抗桑葉生物堿的機制中可能起到一定的作用。桑螟(Diaphania pyloalis Walker)是一種與家蠶親緣關(guān)系較遠但食性一致的桑

2、樹常見害蟲，對桑園產(chǎn)量的危害相當嚴重。桑螟的基因組中同樣存在β-FFase同源基因，但該類基因在桑螟的體內(nèi)外表達情況及功能特性尚不清楚。
　　本實驗首先調(diào)查了桑螟體內(nèi)各組織中β-FFase同源基因的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR結(jié)果表明 DpSuc1a在前腸、中腸和絲腺的表達量相對較高，DpSuc2c在前腸、中腸和脂肪體的表達水平也較高，而DpSuc1b、DpSuc2a和DpSuc2b在桑螟體內(nèi)幾乎沒有表達。其次，研究了桑螟的中腸和絲腺總

3、蛋白的β-FFase酶活性。檢測結(jié)果表明和家蠶一樣，桑螟的中腸確實存在β-FFase，且其活性不受生物堿的影響，具有較高的蔗糖水解酶的活力，而在絲腺中未檢測到β-FFase活性。
　　為了進一步研究桑螟各β-FFase基因的功能特性，我們根據(jù)實驗室前期研究得到的桑螟β-FFase基因的cDNA序列設(shè)計特異性引物，經(jīng) PCR擴增獲得了桑螟5個β-FFase基因和家蠶BmSuc1的全長ORF，構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化、誘導各基因在

4、大腸桿菌中表達，并對重組蛋白進行了純化。Western blot檢測結(jié)果表明除DpSUC1b未表達外，其他基因均表達出可溶性的重組蛋白。然而，相對BmSUC1的活性而言，桑螟的各重組蛋白均未顯示出β-FFase的酶活性。而用重組蛋白DpSUC1a制備的兔源多克隆抗體進行Western blot印跡反應(yīng)的結(jié)果和RT-PCR一致，DpSUC1a主要在桑螟的中腸表達。免疫組織化學分析結(jié)果也表明桑螟的中腸細胞中有DpSUC1a的存在。綜合以上數(shù)