山羊胎兒皮膚黑色素生成有關(guān)miRNA的篩選與鑒定.pdf

1、黑色素生成是復(fù)雜的生理過(guò)程，關(guān)于膚色形成的機(jī)理已經(jīng)在人類醫(yī)學(xué)和多數(shù)動(dòng)物上取得了很大的進(jìn)展，但烏羊的烏皮中烏質(zhì)性狀的形成機(jī)理研究相對(duì)匱乏。微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的、長(zhǎng)度約為18-25nt的內(nèi)源性單鏈RNA，屬于非編碼小分子RNA。研究報(bào)道，miRNAs在皮膚細(xì)胞發(fā)育、被毛及皮膚顏色控制中起著重要的作用。本研究以皮膚miRNA調(diào)控膚色為核心，對(duì)烏皮羊及白皮羊胎兒（100日齡）皮膚組織進(jìn)行小RNA

2、 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及Illumina測(cè)序，尋找差異表達(dá)的miRNAs。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)對(duì)山羊皮膚組織小RNA cDNA文庫(kù)的測(cè)序，得到317個(gè)符合miRNA二級(jí)典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的序列，其中187個(gè)序列是在miRBase v20.0.中已報(bào)道的山羊（capra hircus）和綿羊（ovis aries）的miRNAs;60個(gè)序列是在miRBase v20.0.0中有高度同源的候選miRNAs;70個(gè)序列在m

3、iRBase v20.0中無(wú)任何同源序列，與上述60個(gè)miRNAs合并為本研究新發(fā)現(xiàn)的miRNAs。這些新的miRNAs中103個(gè)隸屬于49個(gè)miRNA家族，剩余的miRNA不屬于任何家族。對(duì)130個(gè)新miRNAs序列進(jìn)行了系統(tǒng)的命名，明確了其在山羊基因組上的座位及正負(fù)鏈上的位置。
　　2.本研究采取三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，通過(guò)三個(gè)比較組對(duì)比，最終在烏皮羊和白皮羊100日齡胎兒皮膚中找到了62個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中31個(gè)在烏皮羊胎兒

4、皮膚中表達(dá)上調(diào)，另外31個(gè)在白皮羊胎兒皮膚中高表達(dá)。此外，我們選取10個(gè)差異表達(dá)的miRNAs對(duì)其進(jìn)行Q-PCR表達(dá)驗(yàn)證，隨機(jī)檢測(cè)的3個(gè)上調(diào)miRNA(oar-miR-544， chi-miR-196a和chi-miR-129-5p)，7個(gè)下調(diào)miRNA(oar-miR-133,oar-miR-381,oar-miR-655,oar-miR-543,oar-miR-299,novel-114和chi-miR-184)的Q-PCR表達(dá)結(jié)果

5、與Illumina測(cè)序分析中得到的結(jié)果相符合。
　　3.對(duì)62個(gè)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)及通路顯著性富集分析，結(jié)果篩選與黑色素生成有關(guān)的86個(gè)候選靶基因。在這些差異表達(dá)miRNAs中，miR-381，miR-543，miR-129在黑色素生成關(guān)鍵基因MITF3'UTR區(qū)域有靶向結(jié)合位點(diǎn);miR-544，miR-129在黑色素生成關(guān)鍵酶TYR3'UTR區(qū)域有靶向結(jié)合位點(diǎn)。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)顯示

6、，miR-381，miR-543，miR-129與MITF具有靶向作用關(guān)系;miR-544，miR-129與TYR有靶向作用關(guān)系。同時(shí)利用基因本體論GO(Gene Ontology)分類對(duì)靶基因功能進(jìn)行了系統(tǒng)的分類，結(jié)果表明這些基因可能參與包括細(xì)胞膜成分、分子功能及生物學(xué)進(jìn)程的多個(gè)環(huán)節(jié)。
　　本研究從不同膚色山羊胎兒皮膚中篩選得到了差異表達(dá)的miRNAs，并初步發(fā)現(xiàn)miR-381，miR-543，miR-129和miR-544可能