楊梅葉原花色素的結(jié)構(gòu)鑒定以及對黑色素生成和細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.，Myricaceae)是華南亞熱帶常綠果樹，近年來對楊梅葉的研究主要集中于從中分離出來的楊梅黃酮，而對于楊梅葉原花色素的研究十分有限。原花色素(PAs)是在植物中分布范圍僅次于木質(zhì)素的次生代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明楊梅葉富含原花色素，且大部分楊梅葉原花色素為原飛燕草素。由于原花色素為聚合物，存在大量結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體，導(dǎo)致其分離方法十分復(fù)雜，給楊梅葉原花色素的研究帶

2、來了困難。
　　本文主要以楊梅葉為研究對象，按照聚合度的不同分離原花色素，對其結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定，并在此基礎(chǔ)上研究了它對黑色素生成的抑制作用和對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)機(jī)理。為了楊梅葉原花色素可以更好的應(yīng)用到實(shí)際的加工利用中，本文還研究了外界條件以及常用化學(xué)基質(zhì)對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響。主要的研究內(nèi)容如下：
　　(1)將楊梅葉通過80％丙酮萃取，Sephadex LH-20柱純化后得到楊梅葉原花色素的粗提物PCBLs。通過

3、其核磁共振結(jié)果證明了楊梅葉原花色素主要由表?xiàng)攦翰杷匚嗨狨?EGCG)的結(jié)構(gòu)單元組成。通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定楊梅葉中的原花色素聚合物結(jié)構(gòu)，并檢測出95種可能的結(jié)構(gòu)。此外，運(yùn)用正相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定低聚原花色素的可能結(jié)構(gòu)，并以此為依據(jù)采用正相制備色譜根據(jù)聚合度分離楊梅葉原花色素，然后運(yùn)用反相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)一步分析，共鑒定出了20種化合物，包括楊梅葉中新被發(fā)現(xiàn)的7種化合物，其中原花色素四聚體、A型連接鍵和包含

4、兩個(gè)(E)GC和一個(gè)(E)GCG的三聚體的結(jié)構(gòu)都是首次報(bào)道。
　　將正相制備色譜中純化到的餾分進(jìn)行組合，分為低聚原花色素(OPAs)和高聚原花色素(PPAs)。OPAs是正相制備液相分離得到的僅含二聚體和三聚體的低聚體提取物，PPAs是包含四聚體及以上的多聚體提取物。以O(shè)PAs、PPAs和粗提物PCBLs為實(shí)驗(yàn)樣品，研究其對黑色素生成和細(xì)胞凋亡的影響。
　　(2)通過研究楊梅葉原花色素對蘑菇酪氨酸酶的抑制、對小鼠B16黑色素

5、瘤細(xì)胞的存活率、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性和細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的影響、抗氧化性以及對對蝦黑變的影響，表明了楊梅葉原花色素具備抑制黑色素生成的能力。PPAs雖然對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性的抑制能力比OPAs弱，但其對蘑菇酪氨酸酶的活性，對細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量的影響都比OPAs強(qiáng)。
　　(3)通過Hoechst33342 DNA染色和AnnexinⅤ+/PI-染色證明了PCBLs、OPAs和PPAs對卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞凋亡起劑量依賴性的誘導(dǎo)作用

6、，PPAs比OPAs對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更有效。PCBLs、OPAs和PPAs都對caspase3/7，8，9有強(qiáng)烈的劑量依賴性的激活作用。細(xì)胞經(jīng)過20或40μg/mL濃度的PPAs處理后，對Caspase3/7，8，9的激活效果最強(qiáng)。通過Western Blot進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PCBLs、OPAs和PPAs增加了促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma、Bax和Bad的表達(dá)，降低了抑凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)，表明其在內(nèi)凋亡途徑中發(fā)揮了作用。

7、PCBLs、OPAs和PPAs增加了DR5和Fas的表達(dá)，證明其對外凋亡途徑也有影響。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCBLs對AKT和p53的表達(dá)沒有明顯的作用，但是OPAs和PPAs對AKT和p53的表達(dá)有顯著的影響。雖然不確定高聚體原花色素能否被吸收利用，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPAs（四聚體及更高聚合度的原花色素）整體上比OPAs（二聚體和三聚體）有更高的細(xì)胞毒性和更強(qiáng)的細(xì)胞凋亡活性。
　　(4)通過穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，外界條件中，自然光、D65

8、和UV光源會一定程度上降低穩(wěn)定性;在30℃到80℃的范圍內(nèi)，楊梅葉原花色素基本穩(wěn)定;在pH值為4.3-8.0范圍內(nèi)，楊梅葉原花色素比較穩(wěn)定。此外，楊梅葉原花色素對Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+這四種常見金屬離子十分敏感。在常用化學(xué)基質(zhì)中，硼酸以影響pH的方式影響原花色素的穩(wěn)定性，保濕劑丙三醇比透明質(zhì)酸鈉對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響更小，防腐劑尼泊金甲酯對原花色素?zé)o顯著性影響，VC可以有效幫助提高楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性。