侵襲性煙曲霉感染特異性甘露聚糖捕獲ELISA和rDNA ITS區(qū)DNA檢測方法的建立及評價(jià).pdf

1、侵襲性曲霉病（invasiveaspergillosis，IA）是一種主要由肺部感染播散至全身多個(gè)臟器的系統(tǒng)性感染疾病，是免疫受損人群的主要致死性并發(fā)癥之一。腐生性絲狀真菌煙曲霉（AspergillusFumigatus）是引起IA的最主要曲霉物種，這主要是由煙曲霉的孢子性質(zhì)決定的，煙曲霉的孢子產(chǎn)量非常大，在環(huán)境中無處不在，平均每人每天可吸入上百個(gè)煙曲霉孢子，同時(shí)，其孢子體積小，易發(fā)生侵入性感染，且吸附能力強(qiáng)，生長速度快，對不良環(huán)境的抵

2、抗力強(qiáng)。對于健康個(gè)體，吸入的孢子可及時(shí)被清除，但是在某些免疫受損患者群中，吸入的煙曲霉孢子可在肺部萌發(fā)、繁殖，引發(fā)肺曲霉病。孢子一旦進(jìn)入血液循環(huán)，則可在其它組織器官定植，造成系統(tǒng)性全身感染，即IA。隨著免疫抑制劑的使用，器官移植、造血干細(xì)胞移植、腫瘤化療等治療手段的出現(xiàn)，以及繼發(fā)性免疫缺陷疾病如AIDS等的出現(xiàn)，導(dǎo)致大量易受煙曲霉感染的免疫缺陷人類宿主出現(xiàn)。對這些免疫缺陷個(gè)體，IA的感染率可高達(dá)50％。即使采用抗真菌治療，死亡率也常常有

3、50％之多。早期快速診斷有助于及時(shí)實(shí)施抗真菌治療，控制病情，改善預(yù)后。然而，在大多數(shù)情況下，診斷問題尚不能解決，延誤了有效的醫(yī)學(xué)治療。
　　 現(xiàn)階段，煙曲霉感染的主要診斷方法包括傳統(tǒng)診斷、基因檢測、特異性抗原抗體檢測等。傳統(tǒng)的診斷方法主要有影像學(xué)、無菌腔液標(biāo)本培養(yǎng)和組織病理學(xué)鑒定等。影像學(xué)上的新月征(aircrescent)和暈輪征(halosign)，由于類似特征在念珠菌病、軍團(tuán)菌病、巨細(xì)胞病毒感染、Kaposi肉瘤等患者體內(nèi)

4、也可觀察到，并不能作為IA確診的依據(jù)。呼吸道分泌物培養(yǎng)診斷敏感性低，而血培養(yǎng)即使在傳播性感染中，也多表現(xiàn)為陰性。此外，標(biāo)本培養(yǎng)還存在培養(yǎng)周期長等缺點(diǎn)。而組織病理學(xué)檢查具有創(chuàng)傷性，并不適用于所有的患者。因此，傳統(tǒng)的診斷方法已難以滿足IA診斷的臨床需要。
　　 IA病情發(fā)展迅速，機(jī)體并無足夠產(chǎn)生抗體的時(shí)間，以及免疫受損患者特異性免疫應(yīng)答水平低的特點(diǎn)，使得抗體檢測易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。同時(shí)，每天吸入空氣中大量煙曲霉孢子，正常個(gè)體機(jī)體內(nèi)所存

5、在的煙曲霉特異抗體，又可導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。因此，單一的特異性抗體檢測在IA診斷中的應(yīng)用價(jià)值一直存在爭議。近年來，IA的診斷學(xué)研究熱點(diǎn)主要集中在抗原捕獲和基因檢測方面。
　　 目前被國際認(rèn)可的具有診斷價(jià)值的真菌抗原主要有兩種:半乳甘露聚糖抗原（Galactomannan，GM）和(1，3)-β-D葡聚糖抗原(β-Dglucan，BG)，這兩種檢測方法已被美國和歐洲許多國家批準(zhǔn)用于侵襲性真菌感染診斷中。然而，這兩種方法具有敏感性

6、和特異性均不穩(wěn)定的應(yīng)有局限性。如GM檢驗(yàn)不能區(qū)分曲霉菌與馬爾尼菲青霉菌的感染，且在病情發(fā)展中很快被清除掉，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。BG檢測（G試驗(yàn)）沒有種屬特異性，不能區(qū)分曲霉與酵母菌感染，對靜脈使用白蛋白或γ球蛋白患者，抗腫瘤藥物如香菇菌多糖使用患者，以及粘菌素E、頭孢噻肟等抗菌藥物使用患者的檢測，均存在出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能。尋找新的特異性抗原靶標(biāo)，建立靈敏度和特異性俱佳的抗原捕獲檢測方法在目前仍顯得尤為重要。
　　 隨著分子生物

7、學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，煙曲霉臨床分離菌株Af293的全基因組測序完成，很多研究工作者把目標(biāo)轉(zhuǎn)向根據(jù)基因組信息設(shè)計(jì)具有種、屬特異性的引物，發(fā)展簡便、快速的IA診斷方法。盡管基因檢測方法要成為診斷IA的常規(guī)檢測方法還存在很多問題，包括方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化困難，對實(shí)驗(yàn)場地的配置、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范性、對人員的要求高等。基因檢測仍具有其它診斷方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，包括可準(zhǔn)確分類到菌株類型，獲得感染物種耐藥性等相關(guān)信息。因此，建立IA患者煙曲霉特異基因檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法

8、，有助于實(shí)現(xiàn)IA的早期快速精確診斷。
　　 由此，本研究的目的主要在于，建立煙曲霉感染特異性抗原捕獲ELISA檢測方法，同時(shí)建立煙曲霉感染基因檢測標(biāo)準(zhǔn)化診斷方法，以求最終實(shí)現(xiàn)煙曲霉感染的早期診斷。研究內(nèi)容主要有:1.重組Afmp1p蛋白的畢赤酵母表達(dá)，抗rAfmp1p單克隆抗體的制備以及煙曲霉感染特異性Afmp1p抗原捕獲ELISA方法的建立與評價(jià)
　　 Afmp1p由AFMP1基因所編碼，為煙曲霉半乳甘露聚糖蛋白，由本

9、實(shí)驗(yàn)室與香港大學(xué)袁國勇教授等人合作，于2001年通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)。在發(fā)現(xiàn)該靶標(biāo)蛋白后，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組GST-Afmp1p融合蛋白，制備抗GST-Afmp1p豚鼠血清，使用多克隆抗體(polyclonalantibody，PAb)夾心法，建立了煙曲霉感染抗原捕獲ELISA檢測方法。然而，該方法對煙曲霉感染IA患者檢測的靈敏度僅為53％，并不能達(dá)到臨床樣本檢測的要求。這可能是由于多克隆抗體本身所具有的缺陷造成的，包括不同

10、批次不同動物間不可避免的血清差異。為了彌補(bǔ)多克隆抗體所存在的缺陷，本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中，使用GST-Afmp1p免疫小鼠，制備抗GST-Afmp1p單克隆抗體(monoclonalantibody，MAb)，獲得了較為理想的抗原夾心捕獲單克隆抗體對，可檢測到0.1ng/ml的重組蛋白。遺憾的是，該方法并不能捕獲天然存在的Afmp1p抗原。這可能緣于大腸桿菌表達(dá)重組GST-Afmp1p蛋白由于缺乏后期修飾，與天然Afmp1p蛋白間存在構(gòu)

11、象差異，從而造成的抗原表位改變。
　　 在本研究中，為了彌補(bǔ)原核表達(dá)系統(tǒng)所存在的無后期加工等缺陷，選擇pPICZα-B表達(dá)載體，使用野生型畢赤酵母33菌株，表達(dá)AFMP1基因，獲得了與天然蛋白更為接近的重組Afmp1p蛋白(rAfmp1p)。使用rAfmp1p免疫小鼠，制備抗rAfmp1p單克隆抗體，對其進(jìn)行HRP標(biāo)記，鑒定亞型，并通過競爭抑制ELISA分析其識別的表位類型。在這些研究的基礎(chǔ)上，將單克隆抗體兩兩配對，進(jìn)行重組蛋白

12、(10ng/μl)夾心捕獲以及感染動物血清10倍稀釋液夾心捕獲篩選，獲得最為理想的MAb抗體對。使用所獲得的最佳抗體對，對重組蛋白倍比稀釋液、多種真菌培養(yǎng)上清稀釋液以及真菌感染兔血清稀釋液進(jìn)行夾心檢測，從而對Afmp1p抗原捕獲ELISA檢測方法的靈敏度與特異度進(jìn)行評價(jià)。2.重組Afmp4p蛋白的畢赤酵母表達(dá)，抗rAfmp4pMAb的制備以及煙曲霉感染特異Afmp4p抗原捕獲ELISA方法的建立與評價(jià)
　　 AFMP4基因所編碼

13、Afmp4p蛋白為Afmp1p同源蛋白，由香港大學(xué)袁國勇教授等人通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)。在Afmp1p做為煙曲霉感染臨床診斷標(biāo)志物的意義尚未確定之時(shí)，對Afmp4p可能的診斷意義進(jìn)行分析，可增加成功建立煙曲霉感染抗原捕獲ELISA檢測方法的幾率。因此本研究在建立Afmp1p抗原捕獲ELISA檢測方法的同時(shí)，同步構(gòu)建pPIC9K-AFMP4重組表達(dá)載體，使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)AFMP4基因，獲得重組Afmp4p蛋白（rAfmp4p），并

14、進(jìn)一步制備鼠源性抗rAfmp4p單克隆抗體，進(jìn)行表位分析與亞型鑒定后，將單克隆抗體兩兩配對，進(jìn)行重組蛋白(10ng/μl)夾心捕獲以及感染動物血清10倍稀釋液夾心捕獲篩選，獲得最為理想的單克隆抗體對。對所獲得的抗體對，使用重組蛋白倍比稀釋液、多種真菌培養(yǎng)上清稀釋液以及真菌感染兔血清稀釋液夾心檢測，評價(jià)方法靈敏度與特異度。
　　 3.煙曲霉感染rDNAITS區(qū)巢式real-timePCR檢測方法的建立
　　 核糖體DNA（

15、ribosomalDNA，rDNA）既有保守區(qū)又有可變區(qū)，在進(jìn)化速率上較為保守，作為種級以上階元的良好標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于物種系統(tǒng)學(xué)研究中。rDNA基因簇從5'到3'端依次為18SrDNA，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internaltranscribedspace，ITS1)，5.8SrDNA，ITS2，28SrDNA。其中，ITSⅠ和ITSⅡ常被合稱為ITS區(qū)。18SrDNA序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)，在進(jìn)化速率上較為保守，是系統(tǒng)發(fā)育中種級以上階元

16、的良好標(biāo)記。ITS區(qū)由于不加入成熟核糖體，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快，在絕大多數(shù)的真核生物中展現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異較明顯，能真實(shí)反映屬間、種間以及菌株間的堿基對差異。因此，不同物種間18SrDNA和ITS區(qū)域的序列差異常用于物種鑒別研究中。
　　 在本研究中，選取針對真菌rDNAITS區(qū)通用引物1對(ITSS:5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3'，ITSR:5’-TCC

17、TCCGCTTATTGATATGC-3')，針對真菌18SrDNA區(qū)域通用引物1對(18SS:5’-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'，18SR:5’-CCGATCCCTAGTCGGCATAG-3')，對真菌基因組DNA、煙曲霉感染兔組織（肝、腎、肺）DNA、黃曲霉感染兔組織（肝、腎、肺）DNA以及模擬真菌敗血癥血液標(biāo)本DNA擴(kuò)增，判斷兩種方法的檢測范圍。同時(shí)對曲霉基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，經(jīng)序列比較分析，選擇出具有物種

18、特異性的檢測靶標(biāo)序列。為了彌補(bǔ)通用引物擴(kuò)增后，產(chǎn)物需進(jìn)一步測序才能鑒別到物種的缺點(diǎn)，對不同真菌的該段序列進(jìn)行比較分析，設(shè)計(jì)曲霉特異real-timePCR引物與探針，嘗試建立曲霉real-timePCR檢測方法。為了彌補(bǔ)曲霉real-timePCR檢測方法靈敏度低的缺陷，進(jìn)一步建立巢式real-timePCR檢測。
　　 小結(jié)
　　 通過以上三部分的工作，本研究所獲得結(jié)果主要有:
　　 1、在畢赤酵母中成功表達(dá)并

19、純化rAfmp1p，獲得的rAfmp1p約為40kDa，略大于預(yù)期的31.4kDa，這可能是由于蛋白糖基化造成的。使用rAfmp1p免疫小鼠，并制備屬源性單克隆抗體，共獲得20株抗rAfmp1p單克隆抗體，分別以Afmp1-M1至Afmp1-M20命名。亞型分析發(fā)現(xiàn)，除Afmp1-M1外，所有的單克隆抗體均為IgG1。表位分析發(fā)現(xiàn)，這20株單克隆抗體可識別6種不同的抗原表位。將這些單克隆抗體兩兩配對，對rAfmp1p(10ng/μl)以

20、及煙曲霉感染兔血清10倍稀釋液雙抗體夾心檢測，篩選獲得了特異性高，靈敏度好的單克隆抗體對，建立了煙曲霉感染Afmplp抗原捕獲ELISA檢測方法。其中，包被抗體為Afmp1-M3（包被濃度為10μg/ml），捕獲抗體為Afmp1-M6-HRP。該Afmp1p抗原捕獲ELISA檢測方法對rAfmp1p檢測的靈敏度為400pg/ml，可捕獲到煙曲霉1640培養(yǎng)上清16倍稀釋液中的Afmp1p抗原，可檢測到煙曲霉感染24h后兔血清16倍稀釋液

21、中的Afmp1p抗原。對其它曲霉感染兔血清以及其它病原真菌1640培養(yǎng)上清的檢測，均表現(xiàn)為陰性。
　　 2、在畢赤酵母中成功表達(dá)并純化rAfmp4p，該蛋白約為20kDa，與預(yù)期大小吻合。使用rAfmp4p免疫小鼠并制備屬源性單克隆抗體，共獲得13株抗rAfmp4p單克隆抗體，以Afmp4-M1至Afmp4-M13命名。亞型分析發(fā)現(xiàn)，所有的單克隆抗體均為IgG1。表位分析發(fā)現(xiàn)，這13株單克隆抗體可識別5種不同的抗原表位。將這些單

22、克隆抗體兩兩配對，對rAfmp4p(10ng/μl)以及煙曲霉感染兔血清10倍稀釋液雙抗體夾心檢測，篩選獲得了特異性高，靈敏度好的單克隆抗體對，建立了煙曲霉感染Afmp4p抗原捕獲ELISA檢測方法。其中，包被抗體為Afmp4-M9（包被濃度為10tg/ml），捕獲抗體為Afmp4-M2-HRP。該Afmp1p抗原捕獲ELISA檢測法對rAfmp4p檢測的靈敏度為800pg/ml，在煙曲霉1640培養(yǎng)上清512倍稀后，仍可捕獲到釋放到培

23、養(yǎng)上清中的Afmp4p抗原，可檢測出煙曲霉感染24h后兔血清8倍稀釋液中的抗原。對其它曲霉感染兔血清以及其它病原真菌1640培養(yǎng)上清的檢測，均表現(xiàn)為陰性。
　　 3、使用真菌18SrDNA通用引物(18SS、18SR)，和真菌rDNAITS區(qū)通用引物(ITSS、ITSR)，對真菌基因組DNA、煙曲霉感染兔組織（肝、腎、肺）DNA、黃曲霉感染兔組織（肝、腎、肺）DNA以及模擬真菌敗血癥血液標(biāo)本DNA的擴(kuò)增，均表現(xiàn)為陽性。對擴(kuò)增產(chǎn)物

24、的直接測序以及Blast分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增出的18SrDNA片段序列(504bp)為真菌共有片段，并無物種特異性，擴(kuò)增出的rDNAITS序列(299bp)具有物種特異性，不同真菌之間，以及曲霉屬內(nèi)不同曲霉之間均存在差異，屬內(nèi)物種序列相似性小于92％。使用rDNAITS區(qū)通用引物PCR擴(kuò)增與直接測序相結(jié)合，可成功對不同的真菌物種進(jìn)行區(qū)分鑒別。通過不同真菌rDNAITS區(qū)的比較分析，設(shè)計(jì)real-timePCR引物，其中上游引物為5’-TATG

25、GGGCTTTGTCACCTC-3'，下游引物為5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3'，Taqman特異探針為5’-CCGGCGCCAGCCGACACCCAACTTTA-3'。該方法對煙曲霉、黃曲霉以及土曲霉DNA檢測表現(xiàn)為陽性，然而ct值高，靈敏度低。由于real-timePCR引物擴(kuò)增片段區(qū)域位于ITS通用引物擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)部，因此建立使用ITS通用引物第一輪擴(kuò)增，real-timePCR引物第二輪擴(kuò)增并熒光檢測的巢式rea

26、l-timePCR檢測方法。該方法最適第一輪擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為15，該方法可成功檢測煙曲霉、黃曲霉以及土曲霉DNA，煙曲霉、黃曲霉感染兔組織（肝、腎、肺）DNA，以及模擬真菌敗血癥血液標(biāo)本DNA。而對其它真菌，包括構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、馬爾尼菲青霉、念珠菌、以及新生隱球菌DNA的檢測，均表現(xiàn)為陰性。
　　 總之，本研究成功建立了3種煙曲霉感染檢測方法，其中2種為煙曲霉特異性甘露聚糖抗原捕獲檢測方法，1種為曲霉特異性巢式real-time