四種微生物多糖合成相關(guān)酶類的生化性質(zhì)與應(yīng)用研究.pdf

1、如同核酸和蛋白質(zhì)，以寡糖和糖復(fù)合物（包括糖蛋白和糖脂）形式存在的糖類化合物也是發(fā)現(xiàn)于所有生命體的重要生物聚合物，它們?cè)诒姸鄰?fù)雜生物過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。糖鏈形式的特定改變與特定的病理狀態(tài)（例如癌癥和炎癥）緊密相關(guān)，這顯示了糖鏈在臨床診斷中的應(yīng)用潛力，以及作為藥物開發(fā)靶標(biāo)的可能性。 細(xì)菌細(xì)胞表面包裹著顯著多樣的多糖結(jié)構(gòu)。其中一種主要的類型是O-多糖（也稱為O-抗原，O-antigen）。O-多糖是細(xì)菌細(xì)胞表面脂多糖（li

2、popolysaccharide，LPS）的主要組成部分之一，它由多個(gè)拷貝（可以多達(dá)100個(gè)）的寡糖重復(fù)單元（O-unit）聚合而成。越來(lái)越多的證據(jù)表明O-多糖在細(xì)菌-宿主相互作用中扮演著重要角色，它們對(duì)病原菌在宿主中的有效定居以及抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)發(fā)揮著不可或缺的作用。因此，對(duì)O-多糖生物合成過(guò)程的闡明有助于開發(fā)細(xì)菌相關(guān)疾病的治療方法。 本論文的目標(biāo)之一即是開發(fā)微生物來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶用于寡糖的酶法合成。我們從大腸桿菌O-抗

3、原生物合成基因簇中鑒定出了三個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)它們的生化性質(zhì)進(jìn)行了研究。除了以揭示它們的底物適應(yīng)性、酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和催化機(jī)理為目的的生化研究工作，本論文還通過(guò)巖藻糖基化寡糖和lacto-系列寡糖的小量合成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些糖基轉(zhuǎn)移酶在寡糖合成中的潛在應(yīng)用價(jià)值。 巖藻糖基化糖鏈結(jié)構(gòu)在真核生物的多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這些過(guò)程包括組織發(fā)育、血管發(fā)生、受精作用、細(xì)胞粘連、炎癥反應(yīng)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等。雖然巖藻糖基化糖鏈結(jié)構(gòu)在原核生物中沒(méi)

4、有在真核生物中那么普遍，但它們也參與病原菌的分子模擬，對(duì)宿主細(xì)胞結(jié)合和定居以及對(duì)宿主免疫反應(yīng)的中和作用。在真核和原核生物中都存在的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase，F(xiàn)ucT）負(fù)責(zé)巖藻糖基化反應(yīng)，將巖藻糖苷從供體巖藻糖鳥苷酸二磷酸（guanosine-diphosphate fucose，GDP-Fuc）轉(zhuǎn)移到各種受體分子上，這些受體分子可能為寡糖、糖蛋白或糖脂。我們鑒定和生化定性了兩種微生物來(lái)源的α1，2-FucTs

5、，并利用重組酶合成了兩種巖藻糖基化寡糖。 來(lái)源于Escherichia coli O128：B12的wbsJ基因編碼一個(gè)負(fù)責(zé)在O-抗原重復(fù)單元半乳糖殘基上添加α1，2.連接巖藻糖的α1，2-FucT。通過(guò)在蛋白N端融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST），WbsJ在E.coli BL21（DE3）中以融合蛋白的形式得到了過(guò)量表達(dá)。應(yīng)用GST親和層析和進(jìn)一步的分子篩層析可以純化得到組分均

6、一的GST-WbsJ融合蛋白。使用各種受體底物進(jìn)行的活性測(cè)定證明融合蛋白表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，對(duì)Galβ1，3GalNAc（T抗原），Galβ1，4Man和乳糖（Galβ1，4Glc）表現(xiàn)出較高的活性，對(duì)Galβ-O-Me和半乳糖的活性次之。一種天然二糖乳果糖（lactulose，Galβ1，4Fru）被發(fā)現(xiàn)是GST-WbsJ的最好底物，酶對(duì)其反應(yīng)速度是對(duì)乳糖的四倍。動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)GST-WbsJ對(duì)乳糖比對(duì)乳果糖的親和力強(qiáng)，其親和常數(shù)

7、Km分別為7.81mM和13.26 mM。但是，酶對(duì)乳糖的kcat/Km值（6.36 M-1·min-1）卻只有對(duì)乳果糖的（13.39 M-1·min-1）一半左右。另外，研究發(fā)現(xiàn)GST-WbsJ的α1，2-FucT活性不依賴于Mn2+或Mg2+等二價(jià)金屬離子。酶的活性還被GDP競(jìng)爭(zhēng)性抑制，其抑制常數(shù)K1為1.41mM。為研究WbsJ的高度保守功能域H152xR154R155xD157的功能，我們進(jìn)行了點(diǎn)突變和GDP-bead結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

8、與對(duì)α1，6-FucTs進(jìn)行的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，WbsJ在此功能域的突變子都沒(méi)有完全喪失活性。但是，結(jié)果證明R154和D157殘基在供體結(jié)合以及酶的催化活動(dòng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。H152和R155也對(duì)酶與GDP-Fuc的結(jié)合十分重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)暗示在α1，2-FucTs和α1，6-FucTs都存在的HxRRxD功能域在酶與底物結(jié)合與催化活動(dòng)中的功能不盡相同。最后，以Galβ-O-Me和乳糖-β-N3為受體底物，使用重組純化的融合蛋白

9、成功合成了毫克級(jí)的巖藻糖基化寡糖。 另一個(gè)細(xì)菌α1，2-FucT編碼基因，wbwK，來(lái)源于E.coli O86，也以GST融合蛋白的形式進(jìn)行了成功的表達(dá)和純化。WbwK在非二價(jià)金屬離子依賴性方面表現(xiàn)出與WbsJ相似的特性。但是，與WbsJ的廣泛底物適應(yīng)性不同，WbwK底物特異性非常嚴(yán)格，僅識(shí)別Galβ1，3GalNAcα-OBn（Me）（T-抗原衍生物）作為底物合成Ⅲ型H血型抗原，而對(duì)簡(jiǎn)單單糖底物半乳糖及其衍生物和其它寡糖底物沒(méi)

10、有活性。WbwK和WbsJ都能以T抗原為受體，只是受體底物廣泛性不同。一種假說(shuō)認(rèn)為糖基轉(zhuǎn)移酶序列中的高變區(qū)決定著其底物特異性。為驗(yàn)證此假說(shuō)，我們對(duì)WbsJ和WbwK進(jìn)行了高變區(qū)互換實(shí)驗(yàn)，結(jié)果形成六個(gè)嵌合體蛋白。盡管區(qū)域互換嚴(yán)重影響了酶的功能，使其中三個(gè)嵌合體喪失功能，另外三個(gè)嵌合體酶活也很低；但是三個(gè)具有酶活的嵌合體表現(xiàn)出廣泛的底物特異性。這顯示出高變區(qū)在決定受體底物適應(yīng)性上的可能作用。 糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基化反應(yīng)需要以高能量的

11、糖核苷為供體底物。特別的，F(xiàn)ucT需要以GDP-Fuc為供體。GDP-Fuc在體內(nèi)有兩種合成途徑，以GDP-甘露糖為起始物的從頭合成途徑，以及以巖藻糖、ATP和GTP為反應(yīng)物的拯救途徑。我們克隆并在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)了在細(xì)菌中負(fù)責(zé)GDP-Fuc拯救途徑合成的雙功能酶FKP，這是在細(xì)菌中目前發(fā)現(xiàn)的唯一的GDP-Fuc拯救合成途徑。在體外反應(yīng)中，F(xiàn)KP表現(xiàn)出GDP-Fuc合成功能，可以應(yīng)用于GDP-Fuc的體外大量低成本合成。除此之外，利用

12、毛細(xì)管電泳檢測(cè)FKP反應(yīng)還發(fā)現(xiàn)FKP具有廣泛的底物適應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)的九種巖藻糖類似物中的七種被FKP以不同的反應(yīng)活性轉(zhuǎn)化生成相應(yīng)的核苷供體。這為體外酶法合成巖藻糖基化寡糖類似物奠定了條件。為檢驗(yàn)FKP在體內(nèi)條件下的底物適應(yīng)性并開發(fā)應(yīng)用于多糖代謝改造，我們將其引入GDP-Fuc從頭合成途徑敲除的E.coli O86：B7菌株中。以巖藻糖類似物喂食這種GDP-Fuc合成途徑工程化后的菌株時(shí)，巖藻糖類似物被細(xì)菌的多糖合成途徑利用，最終整合到表面多

13、糖結(jié)構(gòu)中，從而實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)重塑多糖的體內(nèi)合成。對(duì)重塑多糖進(jìn)行的CE-MS檢測(cè)證實(shí)了其結(jié)構(gòu)。通過(guò)此方法引入細(xì)胞表面多糖的化學(xué)功能性集團(tuán)，包括疊氮和氨基集團(tuán)，可以通過(guò)體外選擇性化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步修飾和熒光標(biāo)記。這項(xiàng)研究提供了一種在多糖中引入結(jié)構(gòu)修飾的簡(jiǎn)單而有效的方法。這一技術(shù)為多糖在生命過(guò)程中的功能研究和機(jī)理揭示提供了強(qiáng)大的工具。 半乳糖殘基在原核和真核生物的多種糖綴合物中廣泛存在，并發(fā)揮重要作用。各種連接的半乳糖基結(jié)構(gòu)是生命體中糖鏈

14、高度多樣性的重要表現(xiàn)形式。各種半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（galactosyltransferase，GalT）催化半乳糖基化反應(yīng)，生成不同連接的糖苷鍵，包括α1，2-，α1，3-，α1，4-，α1，6-或β1，3-，β1，4-連接。乳-N-二糖I（lacto-N-biose I，Galβ1，3GlcNAc），即I型核心糖鏈，是人體中很多糖表位的組成部分，例如Lea，Leb和SLea抗原。Galβ1，3GlcNAc結(jié)構(gòu)還存在于其它重要多糖，如乳-N

15、-四糖（lacto-N-tetraose，LNT）中。 我們由E.coli055：H7的O-抗原合成基因簇中鑒定出一個(gè)β1，3-GalT編碼基因，wbgO。WbgO以GST融合蛋白的形式進(jìn)行了重組表達(dá)并通過(guò)GST親和層析純化得到比活力為67.5 mU mg-1的均一蛋白。其β1，3-GalT活性通過(guò)放射性活性檢測(cè)和對(duì)其合成的二糖產(chǎn)物的ESI-MS和NMR結(jié)構(gòu)分析得到了驗(yàn)證。與GST的融合對(duì)其可溶性表達(dá)和有效純化是必要的。融合蛋白

16、在pH6.0-8.0條件下表現(xiàn)較好催化活性，且最適pH值為7.0。另外，它還對(duì)緩沖體系具有偏好性，HEPES是用于實(shí)驗(yàn)的四個(gè)緩沖體系（包括HEPES，Tris-HCl，MES和檸檬酸鈉）中最適合的。其活性依賴于特異的二價(jià)金屬離子（Mn2+和Mg2+）。N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）以及以GlcNAc為非還原端的寡糖是其主要受體。但是，N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）以及以GalNAc為非還原端的寡糖也可以作為其受體。乳-N-三糖（la

17、cto-N-triose，GlcNAcβ1，3Galβ1，4 Glcβ-OBn）是實(shí)驗(yàn)的所有受體中最好的。酶對(duì)底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)與底物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。最后，使用重組酶，以乳-N-三糖為受體成功合成了LNT寡糖。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過(guò)ESI-MS和NMR分析得到了證實(shí)。TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組酶可以實(shí)現(xiàn)受體底物的完全轉(zhuǎn)化，顯示出此酶作為寡糖合成工具酶的潛在應(yīng)用價(jià)值。 總之，本論文以三種糖基轉(zhuǎn)移酶和一種糖核苷合成酶的生化定性為中心，提高了人們對(duì)