綿羊外周血中游離DNA應(yīng)用于胎兒性別鑒定以及基因分型的初步研究.pdf

1、目的:外周血中游離的DNA主要是指存在于血漿,血清等循環(huán)系統(tǒng)里的一些小片段DNA。它是機(jī)體代謝的正常生理表現(xiàn),但是在一些病變或類病變機(jī)體中這類游離的DNA的含量和組成會發(fā)生變化。這些研究結(jié)果在一些疾病的臨床診斷以及非創(chuàng)傷性早期妊娠診斷方面給人們提供了一個新的檢測診斷方法。本研究應(yīng)用三種方法從綿羊外周血漿/血清中分離提取游離 DNA,建立高效的外周血游離 DNA提取方法,并對 SRY基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增開展早期胎兒性別鑒定,同時對利用游離

2、DNA進(jìn)行基因突變篩選的可行性做初步的研究。
　　方法:
　　1、綿羊外周血中游離DNA提取及SRY基因檢測。利用加熱法、酚氯仿法以及試劑盒從500μL血漿/血清中提取游離的DNA。根據(jù)游離DNA片段的特點(diǎn)分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為168 bp的MC1R檢測引物和178 bp的SRY基因引物進(jìn)行普通PCR檢測。
　　2、不同妊娠時期胎兒性別鑒定。利用試劑盒提取血漿樣品中游離 DNA,設(shè)計(jì)巢式PCR引物,優(yōu)化擴(kuò)增體系。對SRY基

3、因特異性擴(kuò)增,并統(tǒng)計(jì)各個妊娠階段的檢測結(jié)果與分娩結(jié)果分析。
　　3、利用酶切及HRM技術(shù)對血漿DNA中綿羊FecB基因進(jìn)行分型效果研究。
　　結(jié)果:
　　1、利用加熱法、酚氯仿法、試劑盒法都提取到了游離的DNA,PCR后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到了168 bp的目的片段。同時利用 PCR擴(kuò)增到了178 bp的SRY基因目的片段。
　　2、通過對結(jié)果分析顯示,陽性檢出率隨著妊娠時期的推移而增加。3wk-6wk以內(nèi)總共

4、17個樣本其中SRY檢測結(jié)果陽性為11個,分娩結(jié)果公羊?yàn)?0只,SRY檢出率為88.2％(10/11)。6wk以上23個樣本,SRY檢測陽性樣本為17個,分娩結(jié)果公羊?yàn)?7只SRY基因檢出率達(dá)到88.2%(15/17)。
　　3、利用高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)對綿羊FecB基因多態(tài)位點(diǎn)分型結(jié)果與測序后結(jié)果相比較準(zhǔn)確率達(dá)到95.83%。
　　結(jié)論:
　　1、不同的提取方法均可有效提取分離綿羊外周血血清和血漿中游離的