調節(jié)性T細胞下調對小鼠腹腔人食管癌移植瘤的影響.pdf

1、背景與目的:食管癌是一種嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率一直居高不下，我國是食管癌高發(fā)區(qū)之一。近年來，隨著認知水平的提高，人們對食管癌展開了大量的臨床及基礎研究，在其發(fā)生發(fā)展及診療等方面取得了長足進展，但其防治工作仍未達到令人滿意的程度，食管癌5年生存率始終低于30％。腫瘤進展是一個多因素、多基因、多階段過程，免疫機制及相關治療在遏制其發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。作為一種特殊的T細胞亞群，CD4+CD25+Foxp3

2、+調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)在腫瘤進展中具有重要的意義，它促使腫瘤細胞免于機體免疫應答，在胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中均表達上調。如何降低其對免疫應答的抑制作用，使腫瘤生物免疫治療達到預期目的漸漸成為人們研究的熱點，目前國內外關于其下調與食管癌腫瘤免疫之間的研究尚少。本研究旨在通過腹腔移植建立荷人食管癌小鼠主動免疫模型，尾靜脈注射CD25及Foxp3單克隆抗體后觀察Treg細胞的下調及其

3、對小鼠抗腫瘤免疫效應的影響，以期為食管癌生物免疫治療提供相應依據(jù)。
　　 方法:將新鮮的人食管癌組織移植于48只BALB/c小鼠腹腔內，隨機分為對照組、CD25單克隆抗體組、Foxp3單克隆抗體組及CD25與Foxp3聯(lián)合單克隆抗體組四組。對照組小鼠0.2mlPBS/只，CD25單抗組125ug/只，F(xiàn)oxp3單抗組50ug/只，聯(lián)合單抗組62.5ugCD25單抗+25ugFoxp3單抗/只，以上三組單抗均溶于0.2mlPBS中

4、后行尾靜脈注射，于瘤體移植前3天及移植后1天進行。移植后2、4天各組處死2只小鼠，觀察瘤組織消長情況、淋巴細胞浸潤情況;移植后6天處死剩余小鼠，觀察小鼠一般情況、瘤塊消長情況、淋巴細胞浸潤情況、免疫器官指數(shù)、外周血Treg細胞表達情況、瘤組織Foxp3免疫組化染色強度等。分析Treg細胞下調情況及其對小鼠體內特異性細胞免疫、移植瘤組織病理變化等的影響。應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫進行資料錄入分析，方差分析比較四組小鼠移植前體重

5、、移植瘤初始重及體積、處死時鼠重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、外周血Treg細胞表達之間的差異;多個獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗比較四組小鼠處死時瘤重及體積之間的差異;Fisher確切概率法、多個樣本率兩兩比較四組小鼠處死時移植瘤組織淋巴細胞浸潤程度及Foxp3免疫組化染色強度之間差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，多個樣本兩兩比較時，根據(jù)公式α(')=α/[k(k-1)]調整檢驗水準，以P＜α'表示差異有統(tǒng)計學意義。
　

6、　 結果:
　　 1.各組小鼠至處死前一般狀況較好，移植前后小鼠體重各組之間無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;
　　 2.各組小鼠外周血Treg細胞占CD4+T細胞的比例分別為（7.083±2.002）％、（1.934±1.186）％、（5.738±1.772）％及（3.772±1.120）％，CD25及聯(lián)合單抗處理組小鼠外周血中Treg細胞較低，各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;
　　 3.各組小鼠移

7、植時瘤組織重量及體積無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，處死時四組瘤組織均有不同程度的壞死，重量及體積較移植時均有所下降?？贵w注射組小鼠移植瘤重量及體積均小于對照組，CD25單抗組小鼠人食管癌細胞很快受到排斥，在移植后第6天處死時瘤細胞可見度明顯下降，瘤重量及體積最小，而后依次是聯(lián)合單抗注射組、Foxp3單抗注射組;
　　 4.各組小鼠胸腺指數(shù)分別為（17.483±4.998）、（35.234±11.354）、（21.441±4.

8、754）及(28.512±7.015)10mg.g-1，脾臟指數(shù)分別為(32.547±10.824)、（47.083+12.133）、（34.618±12.153）及（41.897±18.905）10mg.g-1，兩個指標各組之間差異有顯著統(tǒng)計學意義。與對照組比較，CD25單抗、聯(lián)合單抗注射組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)oxp3單抗組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義;與CD25單抗組比較，F(xiàn)oxp3單抗、

9、聯(lián)合單抗組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著下降（其中，F(xiàn)oxp3&CD25單抗組P＜0.01，聯(lián)合&CD25單抗組P＜0.05）;而與Foxp3單抗組比較，聯(lián)合單抗組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)顯著升高(P＜0.05);
　　 5.各組小鼠之間移植瘤淋巴細胞浸潤程度差異有顯著性(P＜0.05)。與對照組相比，CD25單抗及聯(lián)合單抗組小鼠瘤組織淋巴細胞浸潤程度較高;Foxp3單抗組及聯(lián)合單抗組小鼠瘤組織淋巴細胞浸潤程度不及CD25單抗組;聯(lián)合單抗組小

10、鼠瘤組織淋巴細胞浸潤程度高于Foxp3單抗組。CD25及聯(lián)合單抗組小鼠移植后早期即出現(xiàn)淋巴細胞浸潤，隨著時間遷移，瘤細胞逐漸退變消失，淋巴細胞浸潤及纖維組織增生逐漸增加;對照組、Foxp3單抗組小鼠早期移植瘤細胞異型性較高，出現(xiàn)淋巴浸潤及瘤細胞壞死時間晚于上述兩組，纖維組織及淋巴細胞浸潤增生程度不及上述兩組。
　　 6.移植前留取相同瘤源患者的部分食管癌組織染色強度為強陽性(+++)，F(xiàn)oxp3主要在細胞核及細胞漿中表達。處死時

11、小鼠移植瘤組織Foxp3表達較移植前均下降，四組小鼠移植瘤組織中Foxp3的表達有顯著性差異(P＜0.05)，對照組中，陽性表達率為87.5％，其中弱陽性表達(+)6例，中度陽性表達(++)1例;CD25單抗組小鼠瘤組織中僅3例(37.5％)為弱陽性表達，其余均為陰性表達;Foxp3單抗組小鼠中，6例為弱陽性表達(75％)，2例為陰性;聯(lián)合單抗組小鼠移植瘤組織陽性及陰性表達各占50％。CD25單抗組Foxp3表達陽性率最低，由此依次為聯(lián)

12、合單抗組、Foxp3單抗組及對照組，但分別比較時，對照組與Foxp3單抗組、CD25單抗組與聯(lián)合單抗組之間無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 結論:CD25單抗組小鼠至處死時外周血中Treg細胞水平最低，移植瘤壞死程度最高，體重及體積較之前減少最多，聯(lián)合單抗組次之，F(xiàn)oxp3單抗組小鼠Treg細胞比例與對照組之間無明顯統(tǒng)計學差異，兩組小鼠瘤組織重量、體積下降程度也不及以上兩組。Treg細胞在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了至關重要的角色，它的負