TRPV4在TGF-β1誘導HSC增殖中的作用及miR-203的調(diào)控研究.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對各種病因所致的慢性損傷產(chǎn)生的修復反應，以膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝內(nèi)大量沉積為其主要特征。肝纖維化持續(xù)發(fā)展最終可形成肝硬化甚至轉(zhuǎn)化成原發(fā)性肝細胞癌，已成為危害人類健康的世界性問題。然而對于肝纖維化迄今仍沒有發(fā)現(xiàn)滿意的治療藥物和方法，闡明肝纖維化形成中相關(guān)的分子機制，對減少肝硬化及原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生具有重要的意義。
　　

2、肝臟受損時，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化增殖在肝纖維化形成過程中起主導性作用。積極尋找導致HSC活化增殖等病理生理過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是防治該病的重點之一。有研究表明，HSC中離子濃度的改變可影響HSC的活化增殖，因此HSC細胞膜上的離子通道成為調(diào)控HSC增殖與凋亡的新靶點。陽離子通道TRPV4是瞬時受體電位通道TRP家族(TRP channels)中的成員之一，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、

3、腎臟、心臟等多種組織，參與聽覺、觸覺、痛覺傳導，及細胞的增殖、遷移、凋亡等多種病理生理過程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， TRP家族成員TRPM7具有抑制HSC增殖并促進其凋亡的作用。本實驗重點研究TRPV4在HSC活化增殖中的作用，及其調(diào)控機制，為肝纖維化防治提供新的靶點。
　　主要研究內(nèi)容概括如下：
　　1. TRPV4在體與離體表達變化
　　以人體肝血管瘤組織為正常肝組織，肝炎后肝硬化脾亢患者及肝癌患者癌旁2cm以外，為

4、肝纖維化組織(經(jīng)病理學組織染色確認)。采用免疫組化、RT-PCT、Western blot等方法檢測TRPV4的基因與蛋白的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常肝組織相比，人體肝纖維化組織中TRPV4基因與蛋白的表達明顯增高。
　　每周2次皮下注射含50％CCl4的植物油溶液(1ml/kg)，建立大鼠肝纖維化模型(共12周)；動物實驗結(jié)果證實，與正常肝組織相比，大鼠肝纖維化組織中TRPV4 mRNA及蛋白表達水平均明顯增高。
　　體外

5、實驗部分以大鼠肝星狀細胞株HSC-T6為研究對象，使用TGF-β1(10ng/ml)處理細胞(24h)，qRT-PCR、Western blot結(jié)果表明，與未誘導組比較，TGF-β1明顯誘導HSC-T6中TRPV4 mRNA與蛋白水平。提示TRPV4可能參與調(diào)控HSC的活化增殖，影響肝纖維化的進程。
　　2. TRPV4對HSC-T6增殖的影響及部分機制研究
　　TRPV4特異性阻斷劑1uM釕紅(Ru)預處理HSC-T6細胞

6、，加入TGF-β1誘導24h后，MTT檢測結(jié)果表明，與正常HSC-T6細胞比較，釕紅預處理組HSC-T6細胞的增殖明顯受到抑制；qRT-PCR、Western blot檢測顯示，HSC活化標志物α-SMA的mRNA與蛋白明顯降低。利用LipofectamineTM2000介導的siRNA技術(shù)特異性沉默 HSC-T6內(nèi)TRPV4，結(jié)果表明特異性阻斷TRPV4，可明顯抑制HSC-T6增殖與α-SMA mRNA與蛋白的表達水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)

7、，轉(zhuǎn)染TRPV4-siRNA，可明顯抑制AKT的磷酸化水平。提示TRPV4可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路抑制HSC的活化增殖。
　　3. TRPV4上游調(diào)控機制研究
　　課題組前期研究證實，表觀遺傳修飾在肝纖維化形成過程中具有重要作用， miRbase, miRANDA, and Targetscan5.1軟件預測均顯示，TRPV4是miR-203的作用靶標。為探討調(diào)控TRPV4的調(diào)控機制，我們研究了miR-203在肝

8、纖維化組織與HSC的表達變化，及其對TRPV4的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在體肝纖維化組織與離體TGF-β1誘導的HSC-T6中，miR-203表達均明顯降低。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-203的模擬物mimics到HSC-T6細胞內(nèi)，可明顯降低HSC-T6的增殖、α-SMA mRNA與蛋白的表達；并可抑制TRPV4的表達；而應用TRPV4的激動劑，則明顯降低，miR-203的模擬物mimics對HSC-T6增殖的抑制率