飼料中補充有益菌對凡納濱對蝦抗病力及其腸道微生物組成影響的研究.pdf

1、第一部分：蠟樣芽孢桿菌與溶藻膠弧菌作為抗原，免疫SPF新西蘭大白兔，獲得免疫血清，效價均高于1:2000。將免疫兔血清作為一抗，HRP-羊抗兔血清作為二抗，建立了蠟樣芽孢桿菌和溶藻膠弧菌快速檢測的間接ELISA方法。此方法中，兔抗血清最佳稀釋度為1:10000，菌液最佳包被濃度為106CFU/ml，HRP-羊抗兔血清最佳稀釋濃度為1:1000，可檢測細菌最低濃度為104 CFU/ml?？瓜灅友挎邨U菌血清與蘇云金芽孢桿菌有交叉反應，抗溶藻

2、膠弧菌血清與其親緣相近菌株無交叉反應，具有較強的特異性。2012年和2013年，本實驗室分別從斑節(jié)對蝦、中國明對蝦、凡納濱對蝦等9批樣本中分離純化到109株海洋細菌，利用建立的多抗間接ELSIA方法對其中部分菌株進行快速檢測，共檢測出6株溶藻膠弧菌，未檢測出蠟樣芽孢桿菌。
　　第二部分：為了研究美人魚發(fā)光桿菌、蠟樣芽孢桿菌、溶藻膠弧菌、堅強芽孢桿菌對凡納濱對蝦抗WSSV感染的效果，試驗分為6個試驗組（A-F組）、攻毒對照組G組和完

3、全空白對照組H組；將四株活菌美人魚發(fā)光桿菌、蠟樣芽孢桿菌、溶藻膠弧菌、堅強芽孢桿菌分別添加在基礎飼料中，活菌含量為108CFU/g，投喂試驗組 A、B、C、F組對蝦，試驗 E組投喂添加108CFU/g蠟樣芽孢桿菌活菌和109CFU/g美人魚發(fā)光桿菌滅活菌的混合菌飼料，試驗F組投喂添加108CFU/g蠟樣芽孢桿菌活菌和109CFU/g溶藻膠弧菌滅活菌的混合菌飼料；攻毒對照組G組和完全空白對照組H組投喂基礎飼料。連續(xù)投喂21天后，進行攻毒試

4、驗，養(yǎng)殖35天后結束試驗。試驗組A-F組免疫保護率分別46.4％、21.74%、35.29%、19.71%、14.08%、21.25%，攻毒對照組G組全部死亡，空白對照組H組存活率為91.67%，免疫保護率最高組為試驗A組，凡納濱對蝦攝食美人魚發(fā)光桿菌可以顯著提高對蝦抗WSSV感染的能力。美人魚發(fā)光桿菌的具體作用機理，以及對凡納濱對蝦腸道微生物的影響，還需要進一步研究。
　　第三部分：為了研究外源補充美人魚發(fā)光桿菌對凡納濱對蝦抗W

5、SSV感染的效果，以及對其腸道微生物組成的影響。將美人魚發(fā)光桿菌PC463添加在基礎飼料中制成活菌含量為108CFU/g的免疫飼料。實驗對蝦分為3組，實驗組每日投喂免疫飼料，攻毒對照組和完全空白對照組每日投喂基礎飼料。連續(xù)投喂21天后，進行WSSV攻毒實驗，養(yǎng)殖35天后結束實驗。攻毒實驗結果顯示：攻毒對照組對蝦全部死亡，實驗組對蝦平均累積死亡率為53.6%，與攻毒對照組差異顯著（P<0.05）;空白對照組存活率為91.67%。在養(yǎng)殖第0

6、、10、20、28、35天取樣，16S rDNA序列V4區(qū)高通量測序方法檢測對蝦腸道內(nèi)微生物群落的結構及變化情況。實驗表明：（1）健康的凡納濱對蝦腸道微生態(tài)群落以變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)含量高，疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）含量低；其中，變形菌門中以弧菌屬、發(fā)光桿菌屬、假交替單胞菌屬為主，弧菌屬比例為14.5%，擬桿菌門中以黃桿

7、菌屬為主；隨著對蝦的生長，變形菌門含量而逐漸降低，而擬桿菌門含量而逐漸升高。（2）凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后可以引起對蝦腸道內(nèi)變形菌門含量升高，尤其是弧菌含量顯著升高，擬桿菌門含量降低。（3）實驗組對蝦腸道內(nèi)變形菌門含量高于空白對照組，而擬桿菌門含量低于對照組；其中，變形菌門弧菌含量低于對照組，表明美人魚發(fā)光桿菌可以降低對蝦腸道內(nèi)弧菌含量。（4）攝食免疫飼料的實驗組對蝦腸道內(nèi)發(fā)光桿菌屬含量為0.8%，而空白對照組為0.2%，實驗組發(fā)光桿菌

8、屬所占比例變動較小。（5）美人發(fā)光桿菌不能阻止WSSV感染凡納濱對蝦，但可以對對蝦起到免疫保護作用，免疫保護率為46.4%，存活的對蝦未檢出 WSSV。本實驗通過對凡納濱對蝦腸道內(nèi)微生態(tài)群落的研究和分析，可以讓人們了解健康凡納濱對蝦腸道內(nèi)微生物組成及變化情況，以及感染W(wǎng)SSV和添加美人魚發(fā)光桿菌的對腸道內(nèi)微生物組成的影響；尤其攝食添加美人魚發(fā)光桿菌的免疫飼料可以顯著提高對蝦的抗病力，并分析了提高對蝦抗病力的原因，為人們正確認識和使用微生