刺參有益菌制劑的研制與應(yīng)用研究.pdf

1、目前，刺參養(yǎng)殖已成為中國(guó)北方最大的海水養(yǎng)殖種類，養(yǎng)殖面積達(dá)7萬(wàn)公頃，遍布江蘇北部、山東、遼寧、河北等地，年產(chǎn)值約200億元。然而，頻繁發(fā)生的刺參病害問(wèn)題給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展?？股丶跋舅幬锏氖褂媚芤欢ǔ潭染徑饧膊〉陌l(fā)生，但由于其能在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)殘留，并進(jìn)而威脅人類健康，而且大量使用能導(dǎo)致耐藥菌株滋生，目前其使用已受到嚴(yán)格限制。刺參養(yǎng)殖量大，而且不具有特異性免疫，因此通過(guò)疫苗控制刺參病害也不

2、可行。益生菌由于能夠抑制病原微生物、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力，且綠色環(huán)保。因此，人們開始越來(lái)越多的關(guān)注益生菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究。本論文分4部分。 1.采用形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及16S rDNA序列分析等方法，鑒定了3株病原拮抗菌。菌株TYIA-16、TYIA-25’、TYIA-26分別被鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)和屎腸球菌(

3、Enterococcusfaecium)。其中，屎腸球菌能耐低溫，在0℃的極端低溫下也可生長(zhǎng)。 2.研究了菌株TYIA-12(Bacillus atrophaeus)、TYIA-15’(Bacillus subtilis)、TYIA-16(Bacillus subtilis)及TYIA-25’(Bacillus cereus)的生長(zhǎng)特性，得到了試驗(yàn)菌的最適生長(zhǎng)條件以及最佳的發(fā)酵時(shí)間。由于刺參特殊的生活習(xí)性，冬春季是其發(fā)病高峰期，

4、因此進(jìn)行了菌株的溫度試驗(yàn)，結(jié)果表明試驗(yàn)菌株耐高溫，但低于6℃不能生長(zhǎng)，因此在極低溫度下需與其它低溫菌種混合使用。試驗(yàn)菌株均能有效的降解海參餌料，并利用其大量增殖。菌株之間的拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株TYIA-15’能強(qiáng)烈抑制其余3株菌的生長(zhǎng)。 刺參營(yíng)底棲生活，主要以底泥、硅藻、細(xì)菌、有機(jī)碎屑為食，施用的益生菌如何能有效到達(dá)池底并被刺參攝食是一個(gè)有待解決的問(wèn)題。本試驗(yàn)選擇沸石粉(粒徑<80目)作為芽孢桿菌孢子的載體，結(jié)果表明，沸石粉對(duì)試驗(yàn)菌

5、的吸附率達(dá)95％以上。沸石粉投入水體后迅速下沉，95％以上的沸石粉可沉入底部，且對(duì)刺參安全無(wú)害，因此可作為有益菌的有效載體應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖。試驗(yàn)并以沸石粉為載體，制備了芽孢桿菌的活性制劑(活菌量>1.5×109cfu/g)，結(jié)果表明，芽孢桿菌活性制劑能長(zhǎng)時(shí)間保持活性，存放半年后的存活率均在70％以上。 3.將基礎(chǔ)餌料為對(duì)照，分別在餌料中添加1％的單一芽孢桿菌制劑(TYIA-1)和復(fù)合芽孢桿菌制劑(TYIA-12:TYIA-16:T

6、YIA-25'=1:1：1)投喂刺參(制劑中活菌量為1.5×109cfu/g)，以研究芽孢桿菌制劑對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫以及腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，芽孢桿菌制劑能顯著提高刺參的特定生長(zhǎng)率(SGR)及腸道蛋白酶活性(P<0.05)，但降低了刺參腸道淀粉酶活力。體腔液中免疫指標(biāo)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌制劑能顯著提高體腔液中堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性(P<0.05)，對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)活性無(wú)顯著影響。試驗(yàn)組刺參攻毒后的累計(jì)死

7、亡率均低于對(duì)照組，其中，投喂復(fù)合菌劑組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)還表明，芽孢桿菌制劑對(duì)刺參腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)還研究了單一芽孢桿菌制劑對(duì)刺參養(yǎng)殖水質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的溶解氧(DO)略有降低，但對(duì)pH值無(wú)影響：菌株TYIA-15’和TYIA-16能一定程度抑制氨氮濃度的增加：試驗(yàn)組芽孢桿菌數(shù)量先逐漸上升，12～15天達(dá)到高峰后開始下降，對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到芽孢桿菌。 4.從感染“腐皮綜合征”的刺參病灶處

8、分離得到1株優(yōu)勢(shì)細(xì)菌HP1，經(jīng)回接感染試驗(yàn)證實(shí)其為刺參病原菌，采用形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)測(cè)定以及16S rDNA序列分析等方法將其鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。蠟樣芽孢桿菌通常作為益生菌應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌HP1菌株能引起刺參“腐皮綜合征”，建議在水產(chǎn)養(yǎng)殖中要謹(jǐn)慎使用，以避免損失。 本論文以從健康刺參腸道中分離得到的有益菌作為研究對(duì)象，制備了有益菌的活性制劑，并驗(yàn)證了其在刺參養(yǎng)殖中

9、的益生作用。刺參營(yíng)底棲生活，以底泥、硅藻、細(xì)菌、有機(jī)碎屑等為食，且養(yǎng)殖過(guò)程中基本不投餌。因此，施用的有益菌如何有效的到達(dá)池底，減少在水中的損失是使用的關(guān)鍵技術(shù)。本研究表明沸石粉能夠作為有益菌的有效載體，為益生菌在刺參養(yǎng)殖中的使用提供了途徑和方法。試驗(yàn)驗(yàn)證了芽孢桿菌制劑對(duì)刺參養(yǎng)殖的有益作用，表明其能緩解刺參疾病的發(fā)生，為研究刺參的病害防治工作提供了理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。 目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的益生菌多為外來(lái)菌種，大量使用將有可能導(dǎo)致