VEGF和TGF-β1在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)中的作用.pdf

1、目的：
　　1.研究VEGF和TGF-β1對(duì)乳腺癌腋窩淋巴結(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞的影響。
　　2.探討乳腺癌腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制，為抗腫瘤免疫治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、從乳腺癌患者被清掃的腋窩淋巴結(jié)中選取10-15枚質(zhì)軟新鮮的無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，將每枚淋巴結(jié)切成兩半，一半送實(shí)驗(yàn)室作為實(shí)驗(yàn)材料(用機(jī)械法處理淋巴結(jié)獲得細(xì)胞懸液，通過(guò)密度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后培養(yǎng)),另一半送病理科行常規(guī)病理活檢。

2、
　　2、將重懸細(xì)胞置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后吸除原有培養(yǎng)基，重新加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞懸液離心，取上清液凍存，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取少許細(xì)胞行HE、免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)，余進(jìn)行分組繼續(xù)培養(yǎng)。
　　3、將剩余的細(xì)胞分成三組繼續(xù)培養(yǎng)，第一組作為對(duì)照組不加任何細(xì)胞因子，第二組加入VEGF（2ng/ml），第三組加入TGF-β1（20ng/ml）。三組在第四天均半量換液，并保持第二組和第三組各細(xì)胞因子的濃度不變。于第七

3、天收集各細(xì)胞懸液離心，凍存上清液，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取少許細(xì)胞行HE、免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)，余繼續(xù)培養(yǎng)至死亡。
　　4、每天使用倒置顯微鏡觀察并記錄樹(shù)突狀細(xì)胞的形態(tài)、大小的變化。
　　5、于第二天及第七天收集少許細(xì)胞制作細(xì)胞涂片，一部分行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，一部分行免疫組化檢測(cè)S-100蛋白。
　　6、于第二天及第七天收集一定量的細(xì)胞，同時(shí)加入FITC-CD83和PE-CD1a單克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)，并且使用多

4、通道流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。
　　7、于第二天及第七天收集上清液凍存，使用ELISA檢測(cè)上清液中IL-12的含量。
　　結(jié)果：
　　1、可從乳腺癌腋窩淋巴結(jié)中獲得DC細(xì)胞，純度達(dá)到（47.768±2.995）％，經(jīng)培養(yǎng)后可獲得成熟的DC。
　　2、細(xì)胞計(jì)數(shù)：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第二組；第七天第一組與第三

5、組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3、S-100陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　4、CD1a+CD8

6、3-：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　5、CD1a+CD83+：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　6、C

7、D1a-CD83-：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　7、CD1a-CD83+：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.0

8、5），第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　8、CD1a+（CD1a+=CD1a+CD83-+CD1a+CD83+）：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第一組與第二組、第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05)

9、。
　　9、CD83+（CD83+=CD1a-CD83++CD1a+CD83+）：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　10、DC（DC=CD1a-CD83++CD1a+CD83++CD1a+C

10、D83-）：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　11、IL-12p70濃度：三組第七天與第二天比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第七天>第二天；第七天第一組與第二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），

11、第一組>第二組；第七天第一組與第三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第一組>第三組；第七天第二組與第三組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、可從乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)中分離出DC，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)可以發(fā)育成成熟DC。2、VEGF和TGF-β1均對(duì)乳腺癌腋窩淋巴結(jié)來(lái)源DC的生長(zhǎng)和成熟起抑制作用，兩者的差異還需進(jìn)一步研究。
　　3、乳腺癌腫瘤細(xì)胞表達(dá)的VEGF和TGF-β1可能致腋窩淋巴結(jié)內(nèi)DC數(shù)量減少和成