α7nAChR激動劑后處理對大鼠在體心肌缺血-再灌注損傷的保護作用及機制的實驗研究.pdf

1、眾多動物實驗表明,在急性心肌缺血所致的最終心肌梗死面積中,大約50％是由缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury)所引起。雖然缺血預處理(ischemicprecondition)是目前已知的最強大的心肌保護干預措施,但是由于其需要在心肌缺血發(fā)生前實施干預,顯然這在急性心肌梗死的情況下是不可能的,所以其臨床應用受到了極大的限制。雖然缺血后處理(ischemic postconditioning)成功地解決

2、了缺血預處理所存在的干預時機選擇問題,但是由于其與缺血預處理一樣仍然依賴于有創(chuàng)操作,所以其僅可應用于接受冠狀動脈介入治療的患者或針對急性心肌缺血而實施的某些心臟手術中。另外,缺血后處理這一有創(chuàng)性操作本身也并非適用于所有的患者,并有導致病變冠狀動脈破裂或粥樣硬化斑塊脫落等其他并發(fā)癥的高風險。鑒于缺血預處理和缺血后處理的局限性,就臨床應用而言,在心肌缺血發(fā)生后進行藥物治療以獲得有效的心肌保護作用,即“藥物后處理”(pharmacologic

3、alpostconditioning)則具有更大的臨床實際意義。目前,藥物預處理和藥物后處理均已成為缺血預處理或缺血后處理的有效替代途徑。藥物后處理的主要優(yōu)點是臨床應用不受心肌缺血時間的限制、方法簡便、不需要有創(chuàng)操作和費用低廉等。
　　 心肌缺血-再灌注損傷實際上是一種炎癥反應,主要表現為炎癥細胞局部侵潤和炎癥細胞因子大量產生和釋放。晚近研究發(fā)現,膽堿能抗炎通路通過迷走神經作用于α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic

4、acetylcholiner receptor,α7nAChR)能夠抑制炎癥細胞因子的產生和釋放,恢復炎癥反應平衡,并保護機體。研究證實,迷走神經刺激可降低炎癥反應時腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisi factorα,TNF-α)、白介素6(interleukin6,IL-6)和高遷移率組蛋白1(high mobilit),group box1,HMGB1)等炎癥細胞因子的組織和循環(huán)血液水平,而且迷走神經刺激亦可保護缺血-

5、再灌注所致的心肌損傷。由于應用α7nAChR激動劑能夠產生與迷走神經刺激相同的效應,所以作為無創(chuàng)、操作簡單的一種藥物后處理,α7nAChR激動劑可能具有潛在的臨床應用前景。雖然目前已有研究證實α7nAChR激動劑對腎臟缺血-再灌注損傷具有保護作用,但是α7nAChR激動劑對心肌缺血-再灌注損傷的保護作用尚未得到充分研究。
　　 聯合不同干預措施以獲得更好的心肌保護效果一直是心肌缺血-再灌注損傷領域重要的研究方向之一,而缺血后處理

6、和α7nAChR激動劑后處理這兩種具有臨床應用價值的心肌保護干預措施的觸發(fā)機制明顯不同。有鑒于此,我們設計了這個隨機對照實驗,旨在觀察缺血后處理和α7nAChR激動劑后處理的心肌保護效果,并試圖證實聯合應用兩者是否能夠獲得協同性心肌保護作用。另外,本實驗還試圖確定α7nAChR激動劑后處理的最佳干預時間,并研究P13K/Akt和JAK/STAT信號轉導通路在聯合應用缺血后處理和α7nAChR激動劑后處理心肌保護作用中的地位,以探討其相互

7、作用的內在機制。本實驗共分為三部分:
　　 第1部分:PNu282987后處理和缺血后處理對在體大鼠心肌缺血-再灌注損傷及其炎癥反應影響的實驗研究
　　 第1部分實驗的目的是采用大鼠在體心肌缺血.再灌注損傷模型比較性觀察PNU282987后處理和缺血后處理的心肌保護效應,并驗證兩種干預措施在降低心肌梗死面積方面是否存在有協同性作用。
　　 將60只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(體重290-32

8、0g)麻醉后隨機分為六組:空白對照組(S組,n=10)；對照組(C組,n=10)；缺血預處理組(IPC組,n=10)；缺血后處理組(IPOC組,n=10)；PNU282987后處理組(P組,n=10)和聯合應用PNU282987后處理和缺血后處理組(PPOC組,n=10)。所有大鼠開胸后采用絲線將其冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)套扎做成活結。除S組之外,所用大

9、鼠均接受局部心肌缺血30 min(阻斷LAD)和再灌注180 min(開放LAD)的處理。C組不采用任何干預措施；IPC組在結扎LAD前進行3個循環(huán)的缺血預處理,每個循環(huán)是由5 min的LAD阻斷和5 min的LAD開放組成,總處理時間是30 min；IPOC組在再灌注前進行3個循環(huán)的缺血后處理,每個循環(huán)是由10s的LAD開放和10s的LAD阻斷組成,總處理的時間是1min；S組、C組、IPC組和IPOC組大鼠均在30 min缺血后腹腔

10、注射生理鹽水1.5ml。P組于再灌注前腹腔注射PNU2829872.4mg/kg；PPOC組的處理同IPOC組,并于再灌注前腹腔注射PNU2829872.4mg/kg。實驗過程中,連續(xù)監(jiān)測心率(heart rate,HR)、平均動脈壓(meanarterial presure,MAP)和Ⅱ導聯心電圖(ECG),并保持大鼠直腸溫度在36.5～37.5℃之間。在再灌注30 min和180 min時抽取血標本,采用大鼠專用試劑盒分別測定血清心

11、肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac Trooonin-Ⅰ,cTnⅠ)、TNF-α、IL-6和HMGB1濃度。隨后采用伊文思藍和氯化三苯基四氮唑雙重染色檢測心肌梗死面積(infarct size,IS％)。
　　 結果顯示,各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動力學參數的基礎值和心肌缺血后15min的血流動力學參數比較差異均無顯著統計學意義。
　　 再灌注期間S組的心率血壓乘積(rate-pressure product,RPP)

12、顯著高于C組。C組的MAP顯著低于S組、IPC組、IPOC組、P組和PPOC組。與IPC組相比,C組、IPOC組、P組和PPOC組缺血期發(fā)生室性心律失常的大鼠數目顯著增多,并且缺血期室性心律失常評分顯著增高。與C組相比,IPOC組和PPOC組再灌注初期發(fā)生室性心律失常的大鼠數目顯著減少,并且再灌注初期室性心律失常評分也顯著降低。
　　 與C組相比,IPC組、IPOC組、P組和PPOC組的IS％和血清cTnI濃度均顯著降低；與IP

13、C組相比,PPOC組的IS％無顯著統計學差異,雖然IPOC組和P組的IS％顯著增高,但P和PPOC組的TnI血清濃度顯著降低；與IPOC組相比,P組的IS％無顯著統計學差異,但PPOC組的IS％顯著降低,并且P組和PPOC組的TnI顯著降低。析因分析結果顯示,PNU282987后處理和缺血后處理在降低IS％方面無交互作用。
　　 與S組相比,C組再灌注30 min時血清TNF-α和IL-6濃度顯著增高,再灌注180 min時血清

14、TNF-α、IL-6和HMGB1濃度也顯著增高。與C組相比,IPC組、IPOC組、P組和PPOC組再灌注180 min時血清TNF-α和HMGB1濃度均顯著降低；除IPOC組再灌注30 min時血清TNF-α和IL-6濃度顯著增高之外,IPC組、P組和PPOC組再灌注30 min時血清TNF-α和IL-6濃度均顯著降低；并且P組和PPOC組再灌注180 min時的血清IL-6濃度也顯著降低,而IPOC組再灌注180 min時血清IL-6

15、濃度顯著增高。與IPC組相比,IPOC組再灌注30 min時血清TNF-α和IL-6濃度顯著增高,再灌注180 min時血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著增高；P組再灌注30 min時血清TNF-α濃度以及再灌注180 min時血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著降低,但是再灌注30 min時IL-6血清濃度顯著增高；PPOC組再灌注30 min時血清TNF-α和IL-6濃度以及再灌注180 rain時血清IL-6和H

16、MGB1濃度顯著降低。與IPOC組相比,P組和IPOC組再灌注30 min時血清TNF-α和IL-6濃度以及再灌注180 min時的血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度也顯著降低。
　　 第2部分:PNU282987后處理減輕大鼠在體心肌缺血-再灌注損傷最佳干預時間的實驗研究
　　 根據第1部分的研究結果,我們設計了這部分實驗,其目的是探討在心肌缺血再灌注過程中何時實施PNU282987后處理能夠獲得最佳的心肌保護效

17、應,以確定PNU282987后處理的最佳干預時間。
　　 將70只成年雄性SD大鼠(體重290～320g)麻醉后隨機分為七組:空白對照組(S組,n=10)；對照組(C組,n=10):缺血預處理組(IPC組,n=10):PNU282987后處理組(P組,n=10)；再灌注30 min時PNU282987后處理組(P30組,n=10)；再灌注60 min時PNU282987后處理組(P60組,n=10)和再灌注90 min時PNU2

18、82987后處理組(P90組,n=10)。C組、IPC組和P組的處理同第1部分實驗,P30組、P60組和P90組的基本處理與C組相同,但分別在再灌注30 min、60min和90 min時腹腔注射PNU2829872.4mg/kg實施藥物后處理。各項檢測項目同實驗第一部分。但僅在再灌注180 min時采血檢測血清炎癥細胞因子濃度。
　　 結果顯示,各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動力學參數的基礎值和心肌缺血后15min的血流動

19、力學參數比較差異均無顯著統計學意義。再灌注期,C組的MAP顯著低于S組、IPC組、P組、P30組和P60組。心肌缺血期,IPC組發(fā)生室性心律失常的大鼠數目較C組、P組、P30組、P60組和P90組顯著減少,并且室性心律失常評分顯著降低。與IPC組相比,C組、P30組、P60組和P90組再灌注初期室性心律失常評分顯著增高。
　　 與C組相比,IPC組、P組、P30組、P60組和P90組再灌注180 min時的血清cTnI濃度和IS

20、％值均顯著降低。與IPC組相比,P組、P30組、P60組和P90組再灌注180 min時的血清cTnI濃度均顯著降低,但是P組、P30組、P60組和P90組的IS％值顯著增高。與P30組相比,P90組的IS％值顯著增高。
　　 與S組相比,再灌注180 min時血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在C組顯著增高。與C組相比,再灌注180 min時血清TNF-α和HMGB1濃度在IPC組、P組、P30組、P60組和P90組顯著

21、降低,并且再灌注180 min時血清IL-6濃度在P組、P30組、P60組和P90組顯著降低。與IPC組相比,再灌注180 min時血清IL-6和HMGB1濃度在P組、P30組、P60組和P90組顯著降低,再灌注180 min時血清TNF-α濃度在P組顯著降低,但再灌注180min時血清TNF-α濃度在P30和P60組顯著增高。與P組相比,P30組、P60組和P90組再灌注180 min時血清TNF-α和HMGB1濃度顯著增高,但再灌注

22、180 min時血清IL-6濃度顯著降低。與P30組相比,P60組和P90組再灌注180 min時血清TNF-α和HMGB1濃度顯著降低,但再灌注180 min時血清IL-6濃度顯著增高。
　　 第3部分P13K/Akt和JAK/STAT信號轉導通路在聯合應用PNU282987后處理和缺血后處理心肌保護作用機制中地位的研究
　　 本部分實驗的目的是探討PI3K/Akt和JAK/STAT信號轉導通路在聯合應用PNU2829

23、87后處理和缺血后處理心肌保護作用機制中的地位。
　　 25只成年雄性SD大鼠(體重290-320g)麻醉后隨機分為五組:對照組(C組,n=5)；缺血預處理組(IPC組,n=5)；缺血后處理組(IPOC組,n=5)；PNU282987后處理組(P組,n=5)、聯合應用PNU282987后處理和缺血后處理組(PPOC組,n=5)。在開放LAD實施再灌注60 min時結束實驗,取大鼠左心室缺血區(qū)心肌標本。由心肌標本中提取總蛋白和總R

24、NA,采用實時定量聚合酶鏈反應(Real-timequantitative polymerase chain reaction,RQ-PCR)技術觀察Akt和STAT3基因在心肌組織的表達情況,并通過免疫蛋白印跡分析(Western-blotting)技術觀察心肌組織Akt和STAT3蛋白磷酸化情況。
　　 Western—blotting結果顯示,與C組相比,IPC組的p-Akt顯著增強,同時IPOC組的p-Akt和p-STA

25、T3顯著增強。與IPC組相比,P組的p-Akt和p-STAT3顯著減弱,同時PPOC組的p-STAT3也顯著減弱。與IPOC組相比,P組的p-Akt和p-STAT3顯著減弱,PPOC組的p-STAT3也顯著減弱。RQ-PCR結果顯示,IPC組STAT3基因表達較C組和P組顯著增強,而且IPOC組的Akt基因表達較PPOC組顯著增強。
　　 結論:
　　 通過本實驗,我們得出以下結論:
　　 1.PNU282987

26、后處理和缺血后處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用不盡相同。在減小心肌梗死面積方面兩者的作用基本相同,但缺血后處理可顯著抑制再灌注初期室性心律失常的發(fā)生,而PNU282987后處理對再灌注初期室性心律失常則無明顯抑制作用。
　　 2.聯合應用PNU282987后處理和缺血后處理能夠獲得增強的心肌保護作用,并且聯合應用兩種干預措施亦可彌補PNU282987后處理不能抑制再灌注初期室性心律失常的缺點。
　　 3.缺血預處

27、理、PNU282987后處理、缺血后處理以及聯合應用PNU282987后處理和缺血后處理均可明顯抑制心肌缺血.再灌注過程中的炎癥反應,并且是以聯合應用PNU282987后處理和缺血后處理時的炎癥反應抑制作用最強。但是,缺血預處理、PNU282987后處理和缺血后處理的炎癥抑制作用在方式和強度方面存在有一定的差異。
　　 4.再灌注30 min時實施PNU282987后處理的心肌保護效果最佳。
　　 5.缺血預處理和缺血后