α7nAChR激動(dòng)劑后處理對大鼠在體心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、眾多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,在急性心肌缺血所致的最終心肌梗死面積中,大約50％是由缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury)所引起。雖然缺血預(yù)處理(ischemicprecondition)是目前已知的最強(qiáng)大的心肌保護(hù)干預(yù)措施,但是由于其需要在心肌缺血發(fā)生前實(shí)施干預(yù),顯然這在急性心肌梗死的情況下是不可能的,所以其臨床應(yīng)用受到了極大的限制。雖然缺血后處理(ischemic postconditioning)成功地解決

2、了缺血預(yù)處理所存在的干預(yù)時(shí)機(jī)選擇問題,但是由于其與缺血預(yù)處理一樣仍然依賴于有創(chuàng)操作,所以其僅可應(yīng)用于接受冠狀動(dòng)脈介入治療的患者或針對急性心肌缺血而實(shí)施的某些心臟手術(shù)中。另外,缺血后處理這一有創(chuàng)性操作本身也并非適用于所有的患者,并有導(dǎo)致病變冠狀動(dòng)脈破裂或粥樣硬化斑塊脫落等其他并發(fā)癥的高風(fēng)險(xiǎn)。鑒于缺血預(yù)處理和缺血后處理的局限性,就臨床應(yīng)用而言,在心肌缺血發(fā)生后進(jìn)行藥物治療以獲得有效的心肌保護(hù)作用,即“藥物后處理”(pharmacologic

3、alpostconditioning)則具有更大的臨床實(shí)際意義。目前,藥物預(yù)處理和藥物后處理均已成為缺血預(yù)處理或缺血后處理的有效替代途徑。藥物后處理的主要優(yōu)點(diǎn)是臨床應(yīng)用不受心肌缺血時(shí)間的限制、方法簡便、不需要有創(chuàng)操作和費(fèi)用低廉等。
　　 心肌缺血-再灌注損傷實(shí)際上是一種炎癥反應(yīng),主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞局部侵潤和炎癥細(xì)胞因子大量產(chǎn)生和釋放。晚近研究發(fā)現(xiàn),膽堿能抗炎通路通過迷走神經(jīng)作用于α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic

4、acetylcholiner receptor,α7nAChR)能夠抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放,恢復(fù)炎癥反應(yīng)平衡,并保護(hù)機(jī)體。研究證實(shí),迷走神經(jīng)刺激可降低炎癥反應(yīng)時(shí)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisi factorα,TNF-α)、白介素6(interleukin6,IL-6)和高遷移率組蛋白1(high mobilit),group box1,HMGB1)等炎癥細(xì)胞因子的組織和循環(huán)血液水平,而且迷走神經(jīng)刺激亦可保護(hù)缺血-

5、再灌注所致的心肌損傷。由于應(yīng)用α7nAChR激動(dòng)劑能夠產(chǎn)生與迷走神經(jīng)刺激相同的效應(yīng),所以作為無創(chuàng)、操作簡單的一種藥物后處理,α7nAChR激動(dòng)劑可能具有潛在的臨床應(yīng)用前景。雖然目前已有研究證實(shí)α7nAChR激動(dòng)劑對腎臟缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用,但是α7nAChR激動(dòng)劑對心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用尚未得到充分研究。
　　 聯(lián)合不同干預(yù)措施以獲得更好的心肌保護(hù)效果一直是心肌缺血-再灌注損傷領(lǐng)域重要的研究方向之一,而缺血后處理

6、和α7nAChR激動(dòng)劑后處理這兩種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的心肌保護(hù)干預(yù)措施的觸發(fā)機(jī)制明顯不同。有鑒于此,我們設(shè)計(jì)了這個(gè)隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn),旨在觀察缺血后處理和α7nAChR激動(dòng)劑后處理的心肌保護(hù)效果,并試圖證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用兩者是否能夠獲得協(xié)同性心肌保護(hù)作用。另外,本實(shí)驗(yàn)還試圖確定α7nAChR激動(dòng)劑后處理的最佳干預(yù)時(shí)間,并研究P13K/Akt和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在聯(lián)合應(yīng)用缺血后處理和α7nAChR激動(dòng)劑后處理心肌保護(hù)作用中的地位,以探討其相互

7、作用的內(nèi)在機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)共分為三部分:
　　 第1部分:PNu282987后處理和缺血后處理對在體大鼠心肌缺血-再灌注損傷及其炎癥反應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 第1部分實(shí)驗(yàn)的目的是采用大鼠在體心肌缺血.再灌注損傷模型比較性觀察PNU282987后處理和缺血后處理的心肌保護(hù)效應(yīng),并驗(yàn)證兩種干預(yù)措施在降低心肌梗死面積方面是否存在有協(xié)同性作用。
　　 將60只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(體重290-32

8、0g)麻醉后隨機(jī)分為六組:空白對照組(S組,n=10)；對照組(C組,n=10)；缺血預(yù)處理組(IPC組,n=10)；缺血后處理組(IPOC組,n=10)；PNU282987后處理組(P組,n=10)和聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和缺血后處理組(PPOC組,n=10)。所有大鼠開胸后采用絲線將其冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)套扎做成活結(jié)。除S組之外,所用大

9、鼠均接受局部心肌缺血30 min(阻斷LAD)和再灌注180 min(開放LAD)的處理。C組不采用任何干預(yù)措施；IPC組在結(jié)扎LAD前進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的缺血預(yù)處理,每個(gè)循環(huán)是由5 min的LAD阻斷和5 min的LAD開放組成,總處理時(shí)間是30 min；IPOC組在再灌注前進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的缺血后處理,每個(gè)循環(huán)是由10s的LAD開放和10s的LAD阻斷組成,總處理的時(shí)間是1min；S組、C組、IPC組和IPOC組大鼠均在30 min缺血后腹腔

10、注射生理鹽水1.5ml。P組于再灌注前腹腔注射PNU2829872.4mg/kg；PPOC組的處理同IPOC組,并于再灌注前腹腔注射PNU2829872.4mg/kg。實(shí)驗(yàn)過程中,連續(xù)監(jiān)測心率(heart rate,HR)、平均動(dòng)脈壓(meanarterial presure,MAP)和Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG),并保持大鼠直腸溫度在36.5～37.5℃之間。在再灌注30 min和180 min時(shí)抽取血標(biāo)本,采用大鼠專用試劑盒分別測定血清心

11、肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac Trooonin-Ⅰ,cTnⅠ)、TNF-α、IL-6和HMGB1濃度。隨后采用伊文思藍(lán)和氯化三苯基四氮唑雙重染色檢測心肌梗死面積(infarct size,IS％)。
　　 結(jié)果顯示,各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)值和心肌缺血后15min的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 再灌注期間S組的心率血壓乘積(rate-pressure product,RPP)

12、顯著高于C組。C組的MAP顯著低于S組、IPC組、IPOC組、P組和PPOC組。與IPC組相比,C組、IPOC組、P組和PPOC組缺血期發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目顯著增多,并且缺血期室性心律失常評(píng)分顯著增高。與C組相比,IPOC組和PPOC組再灌注初期發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目顯著減少,并且再灌注初期室性心律失常評(píng)分也顯著降低。
　　 與C組相比,IPC組、IPOC組、P組和PPOC組的IS％和血清cTnI濃度均顯著降低；與IP

13、C組相比,PPOC組的IS％無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,雖然IPOC組和P組的IS％顯著增高,但P和PPOC組的TnI血清濃度顯著降低；與IPOC組相比,P組的IS％無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但PPOC組的IS％顯著降低,并且P組和PPOC組的TnI顯著降低。析因分析結(jié)果顯示,PNU282987后處理和缺血后處理在降低IS％方面無交互作用。
　　 與S組相比,C組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α和IL-6濃度顯著增高,再灌注180 min時(shí)血清

14、TNF-α、IL-6和HMGB1濃度也顯著增高。與C組相比,IPC組、IPOC組、P組和PPOC組再灌注180 min時(shí)血清TNF-α和HMGB1濃度均顯著降低；除IPOC組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α和IL-6濃度顯著增高之外,IPC組、P組和PPOC組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α和IL-6濃度均顯著降低；并且P組和PPOC組再灌注180 min時(shí)的血清IL-6濃度也顯著降低,而IPOC組再灌注180 min時(shí)血清IL-6

15、濃度顯著增高。與IPC組相比,IPOC組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α和IL-6濃度顯著增高,再灌注180 min時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著增高；P組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α濃度以及再灌注180 min時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著降低,但是再灌注30 min時(shí)IL-6血清濃度顯著增高；PPOC組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α和IL-6濃度以及再灌注180 rain時(shí)血清IL-6和H

16、MGB1濃度顯著降低。與IPOC組相比,P組和IPOC組再灌注30 min時(shí)血清TNF-α和IL-6濃度以及再灌注180 min時(shí)的血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度也顯著降低。
　　 第2部分:PNU282987后處理減輕大鼠在體心肌缺血-再灌注損傷最佳干預(yù)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究
　　 根據(jù)第1部分的研究結(jié)果,我們設(shè)計(jì)了這部分實(shí)驗(yàn),其目的是探討在心肌缺血再灌注過程中何時(shí)實(shí)施PNU282987后處理能夠獲得最佳的心肌保護(hù)效

17、應(yīng),以確定PNU282987后處理的最佳干預(yù)時(shí)間。
　　 將70只成年雄性SD大鼠(體重290～320g)麻醉后隨機(jī)分為七組:空白對照組(S組,n=10)；對照組(C組,n=10):缺血預(yù)處理組(IPC組,n=10):PNU282987后處理組(P組,n=10)；再灌注30 min時(shí)PNU282987后處理組(P30組,n=10)；再灌注60 min時(shí)PNU282987后處理組(P60組,n=10)和再灌注90 min時(shí)PNU2

18、82987后處理組(P90組,n=10)。C組、IPC組和P組的處理同第1部分實(shí)驗(yàn),P30組、P60組和P90組的基本處理與C組相同,但分別在再灌注30 min、60min和90 min時(shí)腹腔注射PNU2829872.4mg/kg實(shí)施藥物后處理。各項(xiàng)檢測項(xiàng)目同實(shí)驗(yàn)第一部分。但僅在再灌注180 min時(shí)采血檢測血清炎癥細(xì)胞因子濃度。
　　 結(jié)果顯示,各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)值和心肌缺血后15min的血流動(dòng)

19、力學(xué)參數(shù)比較差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注期,C組的MAP顯著低于S組、IPC組、P組、P30組和P60組。心肌缺血期,IPC組發(fā)生室性心律失常的大鼠數(shù)目較C組、P組、P30組、P60組和P90組顯著減少,并且室性心律失常評(píng)分顯著降低。與IPC組相比,C組、P30組、P60組和P90組再灌注初期室性心律失常評(píng)分顯著增高。
　　 與C組相比,IPC組、P組、P30組、P60組和P90組再灌注180 min時(shí)的血清cTnI濃度和IS

20、％值均顯著降低。與IPC組相比,P組、P30組、P60組和P90組再灌注180 min時(shí)的血清cTnI濃度均顯著降低,但是P組、P30組、P60組和P90組的IS％值顯著增高。與P30組相比,P90組的IS％值顯著增高。
　　 與S組相比,再灌注180 min時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在C組顯著增高。與C組相比,再灌注180 min時(shí)血清TNF-α和HMGB1濃度在IPC組、P組、P30組、P60組和P90組顯著

21、降低,并且再灌注180 min時(shí)血清IL-6濃度在P組、P30組、P60組和P90組顯著降低。與IPC組相比,再灌注180 min時(shí)血清IL-6和HMGB1濃度在P組、P30組、P60組和P90組顯著降低,再灌注180 min時(shí)血清TNF-α濃度在P組顯著降低,但再灌注180min時(shí)血清TNF-α濃度在P30和P60組顯著增高。與P組相比,P30組、P60組和P90組再灌注180 min時(shí)血清TNF-α和HMGB1濃度顯著增高,但再灌注

22、180 min時(shí)血清IL-6濃度顯著降低。與P30組相比,P60組和P90組再灌注180 min時(shí)血清TNF-α和HMGB1濃度顯著降低,但再灌注180 min時(shí)血清IL-6濃度顯著增高。
　　 第3部分P13K/Akt和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和缺血后處理心肌保護(hù)作用機(jī)制中地位的研究
　　 本部分實(shí)驗(yàn)的目的是探討PI3K/Akt和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在聯(lián)合應(yīng)用PNU2829

23、87后處理和缺血后處理心肌保護(hù)作用機(jī)制中的地位。
　　 25只成年雄性SD大鼠(體重290-320g)麻醉后隨機(jī)分為五組:對照組(C組,n=5)；缺血預(yù)處理組(IPC組,n=5)；缺血后處理組(IPOC組,n=5)；PNU282987后處理組(P組,n=5)、聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和缺血后處理組(PPOC組,n=5)。在開放LAD實(shí)施再灌注60 min時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn),取大鼠左心室缺血區(qū)心肌標(biāo)本。由心肌標(biāo)本中提取總蛋白和總R

24、NA,采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitative polymerase chain reaction,RQ-PCR)技術(shù)觀察Akt和STAT3基因在心肌組織的表達(dá)情況,并通過免疫蛋白印跡分析(Western-blotting)技術(shù)觀察心肌組織Akt和STAT3蛋白磷酸化情況。
　　 Western—blotting結(jié)果顯示,與C組相比,IPC組的p-Akt顯著增強(qiáng),同時(shí)IPOC組的p-Akt和p-STA

25、T3顯著增強(qiáng)。與IPC組相比,P組的p-Akt和p-STAT3顯著減弱,同時(shí)PPOC組的p-STAT3也顯著減弱。與IPOC組相比,P組的p-Akt和p-STAT3顯著減弱,PPOC組的p-STAT3也顯著減弱。RQ-PCR結(jié)果顯示,IPC組STAT3基因表達(dá)較C組和P組顯著增強(qiáng),而且IPOC組的Akt基因表達(dá)較PPOC組顯著增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 通過本實(shí)驗(yàn),我們得出以下結(jié)論:
　　 1.PNU282987

26、后處理和缺血后處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用不盡相同。在減小心肌梗死面積方面兩者的作用基本相同,但缺血后處理可顯著抑制再灌注初期室性心律失常的發(fā)生,而PNU282987后處理對再灌注初期室性心律失常則無明顯抑制作用。
　　 2.聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和缺血后處理能夠獲得增強(qiáng)的心肌保護(hù)作用,并且聯(lián)合應(yīng)用兩種干預(yù)措施亦可彌補(bǔ)PNU282987后處理不能抑制再灌注初期室性心律失常的缺點(diǎn)。
　　 3.缺血預(yù)處

27、理、PNU282987后處理、缺血后處理以及聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和缺血后處理均可明顯抑制心肌缺血.再灌注過程中的炎癥反應(yīng),并且是以聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和缺血后處理時(shí)的炎癥反應(yīng)抑制作用最強(qiáng)。但是,缺血預(yù)處理、PNU282987后處理和缺血后處理的炎癥抑制作用在方式和強(qiáng)度方面存在有一定的差異。
　　 4.再灌注30 min時(shí)實(shí)施PNU282987后處理的心肌保護(hù)效果最佳。
　　 5.缺血預(yù)處理和缺血后