督脈電針血清對(duì)急性缺氧脊髓神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)采用針灸血清的藥理學(xué)方法，制備督脈電針治療急性脊髓損傷大鼠后血清，原代培養(yǎng)Sprague Dawley胎鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞并進(jìn)行急性缺氧、NMDA損傷，檢測(cè)血清干預(yù)后細(xì)胞活性，全細(xì)胞膜片鉗模式記錄其各組I NMDA，探討督脈電針血清對(duì)急性缺氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.選取孕14天(E14d)清潔級(jí)SD雌鼠，全麻下取胚鼠，解剖顯微鏡下取脊髓組織，無(wú)血清培養(yǎng)原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀

2、察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征。
　　2.Neuronal ClassⅢβ-Tubulin(Tuj1)和DAPI免疫熒光雙染鑒定神經(jīng)元。
　　3.MTT比色法檢測(cè)不同時(shí)期神經(jīng)元的活性。
　　4.選取清潔級(jí)SD雄鼠12只，隨機(jī)分成三組:假模組、電針組、藥物組，除假模組只將椎板剝除外，余二組均采用MASCIS打擊器設(shè)定高度25cm、重量10g對(duì)其進(jìn)行單次打擊，造模成功后，分別對(duì)電針組、藥物組治療。電針組:韓氏治療儀在傷后0.5h、12

3、h、24h取督脈的大椎、命門(mén)穴電針治療;藥物組:甲基強(qiáng)的松龍?jiān)趥?.5h、12h、24h尾靜脈注射。48h后，全麻下心臟取血，離心后得各組血清，過(guò)濾。
　　5.選取第6-8天原代脊髓神經(jīng)細(xì)胞分成兩批，每批5組，第一批分別為正常組、急性缺氧組、急性缺氧+假模血清組、急性缺氧+電針血清組、急性缺氧+藥物血清組;第二批分別為正常組、NMDA損傷組（100μM，30min）、NMDA損傷+假模血清組、NMDA損傷+電針血清組、NMDA損

4、傷+藥物血清組，采用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活性。
　　6.乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測(cè)上述各組細(xì)胞LDH釋放比。
　　7.Hoechst33342和碘化丙啶(PI)免疫熒光雙染色方法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡和壞死情況。
　　8.選取第8-14天原代脊髓神經(jīng)細(xì)胞，應(yīng)用95％ N2+5％ CO2混合氣體建立脊髓神經(jīng)元急性缺氧模型，全細(xì)胞模式下記錄正常細(xì)胞和急性缺氧細(xì)胞INMDA。
　　9.分別用假模組、督脈電針組、藥物組

5、血清干預(yù)急性缺氧細(xì)胞，記錄INMDA。
　　結(jié)果:
　　1.Neuronal ClassⅢβ-Tubulin(Tuj1)和DAPI免疫熒光雙染鑒定神經(jīng)元，并根據(jù)Tuj1陽(yáng)性率觀察到體外培養(yǎng)原代胎鼠脊髓神經(jīng)元純度達(dá)90％。
　　2.原代脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)，相同批次間細(xì)胞第2、4、6、8、10、14天相互間細(xì)胞活性沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），第16天開(kāi)始細(xì)胞活性下降，第16天細(xì)胞活性與同批次其他時(shí)期細(xì)胞活性間有明顯下降(P＜

6、0.01)。
　　3.MTT比色法、LDH試劑盒分別檢測(cè)不同組血清干預(yù)急性缺氧神經(jīng)元OD值和LDH釋放比。分組:A、a:正常對(duì)照組;B:急性缺氧組;C:急性缺氧+假模血清組;D:急性缺氧+電針血清組;E:急性缺氧+藥物血清組;b:NMDA損傷組（100μM）;c:NMDA損傷+假模血清組;d:NMDA損傷+電針血清組;e:NMDA損傷+藥物血清組。MTT比色法檢測(cè):與A組相比，B、C、D、E組吸光度明顯降低（P＜0.01）;與a組

7、相比，b、c、d、e組吸光度明顯降低(P＜0.01);與B、C組相比，D、E組吸光度升高(P＜0.01);與b、c組相比，d、e組吸光度升高（P＜0.01）;與B組相比，C組吸光度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與b組相比，c組吸光度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與D組相比，E組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與d組相比，e組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。LDH試劑盒檢測(cè)各組:與A組相比，B、C、D、E組LDH釋放百分比明顯升高（P

8、＜0.01）;與a組相比，b、c、d、e組釋放百分比明顯升高（P＜0.01）;與B組相比，C、D、E組釋放百分比降低（P＜0.05）;與b組相比，c、d、e組釋放百分比降低（P＜0.05）;與C組相比，D、E組釋放百分比降低（P＜0.05）;與c組相比，d、e組釋放百分比降低(P＜0.05);與D組相比，E組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與d組相比，e組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.Hoechst33342和碘化丙啶(P

9、I)免疫熒光雙染色后可觀察到督脈電針血清和藥物血清可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死。
　　5.膜片鉗各組細(xì)胞全細(xì)胞模式下誘發(fā)NMDA內(nèi)向電流:急性缺氧神經(jīng)元所記錄INMDA峰值與正常細(xì)胞峰值相比明顯增大（P＜0.01），督脈電針血清和MP血清孵育過(guò)的細(xì)胞誘發(fā)INMDA小于急性缺氧組（P＜0.05），督脈電針血清和MP血清孵育過(guò)的細(xì)胞誘發(fā)INMDA相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.采用無(wú)血清培養(yǎng)方式可建立