Nec-1對(duì)染鋁神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、[目的]觀察和探討Nec-1對(duì)染鋁(Al)神經(jīng)細(xì)胞的作用。
　　 [方法]1.體外原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)細(xì)胞：選用新生1-3d的昆明小鼠，取腦，分離大腦皮質(zhì)進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。2.制造Al損傷神經(jīng)細(xì)胞模型：在細(xì)胞培養(yǎng)第5天左右，選取生長(zhǎng)良好的同批次神經(jīng)細(xì)胞染鋁使其終濃度為2mmol/L。3.加入Nec-1不同劑量0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L進(jìn)行干預(yù)，48小時(shí)后(1)觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并用CC

2、K-8法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；(2)流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV和PI雙染法)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的壞死率和凋亡率；(3)熒光定量PCR法檢測(cè)Nec-1不同劑量作用下神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡及自吞噬基因的表達(dá)量；(4)蛋白印跡法(Western-blot)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡及自吞噬蛋白的表達(dá)量。
　　 [結(jié)果]1.Nec-1對(duì)染鋁神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞活力的影響：(1)光鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示正常神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，有長(zhǎng)且比較

3、均一的軸突，有較多從胞體開始向末梢逐漸變細(xì)的樹突，細(xì)胞與突觸間，胞體與胞體間連接豐富；染鋁(2mmol/L)使神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量減少，胞核分裂，突觸變少變短甚至消失；而隨著Nec-1劑量的加大，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，體積逐漸增大，軸突變長(zhǎng)，且樹突的數(shù)量明顯增多。(2)AO-EB染色結(jié)果顯示，正常細(xì)胞的核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)，加入Al3+(2mmol/L)時(shí)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死現(xiàn)象，隨著Nec-1劑量的增加，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死有

4、明顯的下降。(3)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與染鋁相比較，Nec-1(60μmol/L、90μmol/L)可使細(xì)胞活力升高(P＜0.01)。2.Nec-1在鋁致神經(jīng)細(xì)胞壞死中的作用：(1)流式結(jié)果顯示，Al3+(2mmol/L)作用于神經(jīng)細(xì)胞可使細(xì)胞的壞死率上升(P＜0.01)，而隨著Nec-1劑量的增加，細(xì)胞的壞死率呈下降趨勢(shì)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(2)熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示，以Al3+(2mmol/L)為對(duì)照，

5、Nec-1(60μmol/L、90μmol/L)可使神經(jīng)細(xì)胞的壞死相關(guān)基因RIP1、NFkB的mRNA表達(dá)下降(P＜0.01)。(3)Western結(jié)果顯示，同Al3+(2mM)組比，Nec-1(60μmol/L、90μmol/L)組細(xì)胞NFkB蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；Nec-1(90μmol/L)亦使RIP1蛋白的表達(dá)下降(P＜0.01)。3.Nec-1在鋁致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用：(1)JC-1染色

6、結(jié)果顯示，正常神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位較高，產(chǎn)生紅色熒光；2mM染鋁組神經(jīng)細(xì)胞的線粒體膜電位明顯變低(早期凋亡改變)，產(chǎn)生綠色熒光的細(xì)胞增多；Nec-1(60μmol/L)又使其膜電位升高，產(chǎn)生紅色熒光的細(xì)胞較染鋁組明顯增多。(2)流式結(jié)果顯示，Al3+(2mmol/L)作用于神經(jīng)細(xì)胞可使其凋亡率上升(P＜0.01)，而Nec-1(60μmol/L、90μmol/L)可使細(xì)胞凋亡率下降(P＜0.01)。(3)qRT-PCR結(jié)果顯示，以Al3

7、+(2mmol/L)為對(duì)照，Nec-1(60μmol/L、90μmol/L)可使神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-8、caspase-9的mRNA表達(dá)下降(P＜0.01)。(4)Western結(jié)果顯示，同Al3+(2mmol/L)組比，Nec-1(60μmol/L、90μmol/L)組細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達(dá)亦均呈下降趨勢(shì)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。4.Nec-