雷帕霉素通過下調(diào)DNA和RNA聚合酶抑制前B急淋白血病細(xì)胞的生長.pdf

1、目的：探究雷帕霉素(Rapamycin,Rap)對(duì)于前B淋巴細(xì)胞白血病(Pre-B acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)細(xì)胞生長的影響,并探討其作用機(jī)制。
　　方法：⑴雷帕霉素處理B-ALL細(xì)胞系697細(xì)胞,分別通過苔盼蘭染色細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8試劑盒、CFSE熒光染色以及PI染色流式細(xì)胞儀分析(Flow Cytometry,FCM),分析雷帕霉素對(duì)697細(xì)胞生長、細(xì)胞活性、增殖和細(xì)胞周期的影響。

2、⑵用PI/Annexxin-Ⅴ雙染法檢測(cè)雷帕霉素處理后697細(xì)胞的凋亡水平,并構(gòu)建697-GFP-LC3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,用免疫熒光(Immunofluorescence,IF)和Western blotting檢測(cè)Rap處理后的細(xì)胞自噬以及mTOR信號(hào)。⑶用細(xì)胞周期RT2 Profiler?PCR Array檢測(cè)Rap處理后細(xì)胞周期相關(guān)因子的變化。⑷用甲基綠-派洛寧染色流式法檢測(cè)Rap處理后細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的含量變化,并用熒光定量PCR

3、(Quantitative Real-time PCR,Q-RT-PCR)和Western blotting檢測(cè)Rap處理后與DNA和RNA合成相關(guān)的聚合酶的變化。⑸用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Rap處理后觀察DNA和RNA聚合酶是否與自噬小體存在亞細(xì)胞共定位。
　　結(jié)果：①100ng/ml,200ng/ml,500ng/ml雷帕霉素處理697細(xì)胞均能抑制697細(xì)胞生長,CCK-8結(jié)果顯示Rap對(duì)697細(xì)胞的IC50為100ng/ml,PI

4、染色結(jié)果顯示雷帕霉素引起細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。②雷帕霉素激活697細(xì)胞自噬但不影響細(xì)胞凋亡。③細(xì)胞周期RT2 Profiler?PCR Array結(jié)果顯示,雷帕霉素處理697后細(xì)胞細(xì)胞周期正調(diào)控因子下調(diào)。④雷帕霉素處理后細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA水平降低,并且與DNA復(fù)制及RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的DNA聚合酶δⅠ和RNA聚合酶Ⅱ在RNA和蛋白水平均下調(diào)。⑤雷帕霉素激活的細(xì)胞自噬參與DNA聚合酶δⅠ和RNA聚合酶Ⅱ的下調(diào)過程。
　　結(jié)論：雷